11-21% sacharidov 01% tukov 0,1 2% bielkovín. 2% vlákniny 72% vodných aminokyselín, vitamínov a minerálov. Aminokyseliny zemiakov 2%

Aplikácia membránových adsorbérov a skríningových systémov na cielené spracovanie zemiakových proteínov Thomas Scheper, Alain Graf, S. Beutel, M. Lotz, R. Ulber Leibniz Universität Hannover Callinstr. 3 30167 Hannover Nemecko 1

Dôležitosť zemiakov Približne 220 divo rastúcich druhov a asi 2 000 odrôd známych po celom svete Úroda sveta v roku 2004 predstavuje v roku 2004 v EÚ asi 2,7 milióna ha pestovateľskej plochy; Výťažok 65 miliónov t Približne 30% škrobových zemiakov (25 - 30 rôznych odrôd) Prevádzka kampane (stolové zemiaky od júna do septembra; škrobové zemiaky od augusta do januára) 2

Zloženie zemiakového škrobu 11-21% sacharidov 01% tuku 0,1 2% bielkovín 2% vlákniny 72% vodných aminokyselín, vitamínov a minerálov voda 72% zemiakov aminokyselín 2% škrobu 20% bielkovín 2% ďalších zložiek 2% vlákniny 2% 3

Priemyselná výroba škrobu (Emslandský škrob) Zemiaky Umývanie zemiakov Strúhadlo Dekantér Reverzná osmóza Škrob a vláknina Vysoký sekundárny tok bielkovín Separátor (vymytie škrobu) Zemiaková ovocná voda (KFW) Škrob 4

Pridaná hodnota zemiakového proteínu Asi 6 miliónov t KFW v Európe Voda 94% Zemiaková ovocná voda Aminokyseliny 2% Ostatné zložky 2% Z hľadiska čísel asi 120 000 t zemiakového proteínu Škrob 0,5% Proteíny 2% Zloženie KFW proteínov: 40% patatínu (hlavný glykoproteín) ) 50% inhibítory proteázy (minoritné proteíny) 10% vysokomolekulárne proteíny (polyfenolové oxidázy, kinázy, fosforylázy) 5

Patatínové glykoproteíny pozostávajúce z 362 aminokyselín (bohaté na lyzín a tyrozín) MW = 40-44 kda, pi = 4,5-5,2 (izoformy s rôznymi vzormi glykozylácie) Enzýmové aktivity: aktivita lipidovej transferázy, aktivita lipidovej acylhydrolázy, aktivita esterázy, Osborne a Campbell J. Am. Chem. Soc. 1986, 18, 575 Jacusen a Foote, J. Food Biochem. 1980, 4, 43 6

Skupina proteázových inhibítorov (PI) Heterogénna trieda tepelne stabilných proteínov bohatých na cysteín MW = 4-23 kda; pi = 5,1-9,0 90 Zohrávajú úlohu pri obrane rastlín pred škodcami atď. Inhibičný účinok na serínovú a cysteínproteázu Podporuje pocit sýtosti (inhibítor proteázy II) Možný antikarcinogénny účinok 7 Kennedy a kol., Pharmacol. Ther. 1998, 78, 167-209. Pouvreau a kol., J. Agri a Food Chem 2001, 49 (6), 2864 Hill a kol., Physiol a Behav. 1990, 48, 241

Užívanie frakcií zemiakových bielkovín Nutraceutiká Detská a špeciálna výživa Športová výživa (Amino Mass) Marketing ako látka potlačujúca chuť do jedla (Satise) Lekárske použitie Liečba cukrovky II a rakoviny kože 8

Nutraceutiká Potraviny s pozitívnym fyziologickým účinkom Boj proti chorobám/prevencia, ako aj zvýšenie výkonnosti/pohody V porovnaní s rastom celkového trhu s potravinami (1 - 3% ročne) rastie objem trhu s nutraceutikami ročne približne o 8% (odhadovaný svetový trh 12 miliárd eur). ) Požiadavky: dobrú chuť, praktický, ľahko pochopiteľný efekt, lacný, dobrý vzhľad 9

Tvorba hodnoty zemiakového proteínu KFW Tepelná koagulácia proteínov KFW poskytuje denaturovaný produkt Najmodernejšie vyzrážanie bielkovín 110 C Žiadna bioaktivita Marketing ako krmivo nízkej kvality pre zvieratá Denaturovaná cena zemiakového proteínu za kg ako zemiakový proteín Krmivo pre dobytok: 0,5 až 1 jednoduchá potravinárska prísada: membránový adsorbér 4 až 6 Vision KFW frakcionovaný zemiakový proteín (natívny) izolácia bioaktívnych proteínových frakcií (natívny) marketing ako vysoko kvalitné funkčné zložky odhadovaná predajná cena za kg: cca 50 10

proteínová zmes (proteíny sa viažu podľa izoelektrického bodu) - -SO - 3 OS- 3 - -SO 3 - OS- 3 - -SO 3 - OS- 3 profil cez veľkosť pórov membrány: približne 3,0 µm hrúbka membrány: 180-200 µm plochý modul (analytické účely) špirálový modul (downstreaming proteínu) vertikálny tok na povrch membrány vertikálny tok na povrch membrány

Rozmanitosť ligandov downstream materiálu (katiónové c skupiny, 2+ 2+ protilátky, Ni, Cu) Základný materiál (membrána, guľôčky) podmienky v smere toku (napr. Elektrické pole) väzbová chémia (aldehyd, epoxid)

ligand cieľového proteínu imunoglobulíny rt-pa, rh-gh glyc. proteíny streptavidín His-tag-proteíny plazmidy, proteíny protilátka proteín A konkavalin A biotín Cu, Ni aptaméry

Doska je zostavená z 8-jamkových pruhov

Inteligentné skríning načítania vzorky

katiónový výmenník aniónový výmenný proteín A His-značka protilátka Con A

pridanie vzorky na zachytávaciu membránu

vzorka katexu 6 vzorka anexu 4 vzorka proteínu A 11 vzorka His-tagu 3 vzorka protilátky 10 Con A vzorka 1

01 0,1 02 0,2 03 0,3 04 0,4 05 0,5 06 0,6 07 0,7 08 0,8 09 0,9 10 1,0 11 1,1 12 1,2 katiónový výmenník anexová vzorka 6 vzorka 4 proteín A vzorka 11 vzorka His-tagu 3 vzorka protilátky 10 Con A vzorka 1 gradient chloridu sodného

Membránový adsorbér so zvýšenou mierkou Jednoduché zväčšenie škály Rôzne geometrie a prevádzkové režimy Spinovacie moduly (1,9 7,5 cm 2) Až 2 mg proteínu/cm 2 Moduly Sartobind (15, 75, 100 cm 2) Až 0,8 mg proteínu/cm 2 24 modulov modulu Sartobind MultiSep (0,1 80 m 2) až 0,8 mg bielkovín/cm 2

Separácia proteínov pomocou membránových adsorbérov Použitie aniónových (Q) a katexových (S) membránových modulov (Sartobind 15-100 cm 2) Pufr A Pufr B LC čerpadlo vstrekovací ventil LC čerpadlo miešacia bunka vzorka membránový modul UV detektor vodivosť zberač frakcií 25

Výsledky v laboratórnom meradle Q frakcia: Patatínová S frakcia: Minore proteíny 2,00 1,0 1,75 100 0,9 100 1,50 80 0,8 80 AU [280 nm] 1,25 1,00 0,75 60 40 eluent v% AU [280 nm] 0,7 0,6 0,5 0,4 60 40 eluent v% 0,50 20 0,3 20 0,25 0 0,2 0 0,00 0 5 10 15 20 25 30 35 Čas t v [min] 0,1 0 5 10 15 20 Čas t v [min] Profil zaťaženia a elúcie modulu Q15 Elučný profil modulu S15 26

Výsledky v laboratórnom meradle Kroky procesu Vyrovnanie membránového modulu s 50 mm NaPP (ph 7) Plnenie KFW (zriedené 1: 5, ph 6,5) Opláchnutie 50 mm NaPP (ph 7) Elúcia 0,5 M roztokom NaCl Regenerácia membrány pomocou 1M plniaci objem roztoku NaCl 0,7 L/m² väzbové kapacity plochy membrány S adsorbér: 0,67 mg/cm2 Q adsorbér: 0,23 mg/cm² 27

Separácia proteínov pomocou membránového adsorbéra SDS-PAGE (Tris-HCL, 18%, farbenie Coomassie) Dráha 1: Značka molekulovej hmotnosti lk Dráha 2: Voda z plodov zemiakov zriedená 1:10 Dráha 3 a 4: Elučná frakcia (0,5 M NaCl, Q 15) Dráha 5: Premývacia frakcia Dráha 6: Elučná frakcia (0,5 M NaCI, S15) 28

Charakterizácia Q frakcie - MALDI-MSMS 29

Charakterizácia S frakcie - MALDI-MSMS 4153 7879 7857 Potlačovač chuti do jedla: SATISE S frakcia Inhibítor Kunitz KI Bowman Birk inhibítor BBI karboxypeptidázový inhibítor CPI 20305 100 4271 intenzita [%] relatívna Int 80 60 40 20 4144 3890 4292 8058 10101 20227 S frakcia KI BBI CPI 0 látka potlačujúca chuť do jedla 5000 10 000 15 000 20000 25 000 hmotnosť (m/z) 30

Zvýšenie mierky na úroveň procesu Moduly Sartobind (15, 75, 100 cm 2) Moduly Sartobind MultiSep (6600 cm 2) 31

Inovatívny membránový downstream downstream proces KFW primárne čírenie/mikrofiltrácia pevných látok (proteíny, škrob, vlákna atď.) Lyofilizácia retentátom/sušením rozprašovaním Lyofilizácia/sušením rozprašovaním inhibítory patatínovej proteázy xx.xx.2007 32

Výsledky na stupnici procesu v kroku V [L] t [min] P [bar] Vyváženie 5 32 3,2 20 2,0 (20 mm NaPP, ph 7) KFW zaťaženie 10 5,6 2,2 (mikrofiltrované, 1: 5 zriedený, ph 6,5) Oplachovanie (20 mm NaPP, ph 7) 10 4,2 2,2 Elučný Q modul 7,5 3,0 0,8 (0,5 M NaCl) Elučný S modul 6,0 2,3 1,0 (0,5 M NaCl) regenerácia membrány (1 M NaCl) 5,0 2,0 0,8 S-adsorpčná väzbová kapacita: 1,00 mg/cm2 (malá: 0,67 mg/cm 2), Q adsorbér: 0,37 mg/cm2 (malý: 0,23 mg/cm2) 33

Na získanie sa použije 1m2 membrána (v súčasnosti sa dá dosiahnuť väzba a elúcia 80% proteínov obsiahnutých v KFW): - 3,7 g patatínu - 10 g proteázových inhibítorov - to trvá 20 - 25 minút, čo je nárast plocha membrány nevedie k zvýšeniu časov. Použite KFW 1: 5 zriedený 5 L na 1 m 2 xx.xx.2007 34

Gélová a kapilárna elektroforéza Analýza produktu Premývacie frakcie Elučné frakcie Au (214 nm) S frakcia Q frakcia kda 100 85 70 60 50 40 30 KFW Q membrána S membrána 25 20 0 5 10 15 20 25 Čas migrácie [min] Testy enzymatickej aktivity 15 M patatín (Lipid acylhydroláza) test na patatín. Stanovenie aktivity inhibítora proteázy proti trypsínu. Testy aktivity polyfenol oxidázy l ität 35 PI

Rušivé zložky: Glykoalkaloidy sa nachádzajú hlavne v zemiakovej šupke a mikróboch 20 - 2525 mg/100 g čerstvého produktu ako toxický prah Príznaky: bolesť hrdla, nevoľnosť/zvracanie, hnačka, žalúdočné a črevné kŕče, bolesť hlavy, horúčka, dýchavičnosť, závraty, strata vedomia D-galaktóza N D Glukóza N HO HO OH L-glukóza O β O OH OH OH O β OO HO α O CH 3 OH OH L-ramnóza α-solanín: MW 868,08 g/mol H 3 C HO HO O L-ramnóza α O HO OH OH OO a HO pOO CH3OH OH L-ramnóza a-chakonín: MW 852,08 g/mol 36 Maga; Krit. Rev. Food Sci Nutr 1980; Lee, 12 (4), 371 a kol .; J Agric Food Chem., 2004; 52 (10), 2832

Analýza glykoalkaloidov pomocou HPLC Extrakcia zemiakového proteínu (frakcie) kyselinou octovou Čistenie na pevnej fáze HPLC analýza Výsledok 0,15 Solanínový štandard Štandard Chaconin Standard Výťažok zo zemiakového proteínu AU (200 nm m) 0,10 0,05 Chaconin Lanin So 000 0,00-0, 05 0 5 10 15 20 25 30 35 retenčný čas [min] Kvantitatívne stanovenie glykoalkaloidu do 20 ppm, frakcie získané membránovými adsorbérmi neobsahujú alkaloidy ! 37

Záver Voda z ovocných plodov obsahuje veľké množstvo biologicky cenných proteínov. Proteíny sa doteraz získavali denaturované tepelnou koaguláciou (krmivo pre dobytok). Pomocou inovatívneho membránového procesu je možné proteíny jemne frakcionovať a izolovať v bioaktívnej forme. Vysoká pridaná hodnota toku priemyselného odpadu (KFW), prenos z laboratórneho je možný priemyselný rozsah 38

Priemyselná výroba škrobu a bielkovín Zemiaky Umývanie zemiakov Strúhadlo Dekantér Reverzná osmóza Škrob a vláknité materiály KFW Separátor (vymytie zo škrobu) Inovatívny membránový proces Zrážanie bielkovín 110 C Škrobový frakcionovaný zemiakový proteín (natívny) Denaturovaný zemiakový proteín xx.xx.2007 39

Produkcia proteínov Voda z plodov zemiakov Membrána po prúde Proces Natívne bioaktívne bielkovinové frakcie Patatín Fáza inhibítora proteázy Enzymové aktivity: aktivita lipidovej transferázy aktivita lipidovej acylhydrolázy aktivita esterázy MW = 40-44 44 kda, pi = 4,5-5,2 5,2 xx.xx.2007 41 Inhibičný účinok na serínovú a cysteínproteázu MW = 4-23 kda; pi = 5,1-9,0

Prehľad proteínových frakcií Podiel bielkovín [%] Molárna hmotnosť [kda] Patatín ti 38 40 (80) Potato Inhibitor I (PI-1) 4,5 7,7-7,9 (39) Potato Inhibitor II (PI-2) 22 10, 2 (21) Inhibitor zemiakovej aspartylproteázy (PAPI) 6 19,9-22 Inhibítor zemiakovej cysteinylproteázy (PCPI) 12 20,1-22,8 Inhibítor zemiakovej Kunitzovej proteázy (PKPI) 4 20,22 Iné inhibítory serínovej proteázy (OSPI) ) 1,5 21 - 21,8 Inhibítor zemiakovej karboxypetidázy (PCPI) 1 4,3 Polyfenoloxidázy (PPO) č. 60; 69 Izoenzýmy fosforylázy žiadne informácie 180-600 Škrobové syntázy žiadne informácie 140 Proteínkinázy žiadne informácie žiadne informácie Lektín 1 65,5 xx.xx.2007 42

Obnoviteľné suroviny Poľnohospodárske a lesné výrobky vyrobené v nepotravinárskom priemysle (najmä na výrobu bioenergie) Poľnohospodárske zvyšky Srvátka (spracovanie mlieka) Melasa (spracovanie cukrovej repy) Zemiaková voda (výroba škrobu) Ulber; CIT 2005, 77 No4, 363 xx.xx.2007 43

Zemiakový škrob Ročná produkcia v EÚ 9.1 Miotové škrobové zemiaky majú obsah škrobu až 21% (stolové zemiaky asi 15%) Ryža asi 70-7575%, pšenica 58-64%, kukurica 60-70% Škrob pozostáva z 20% amylózy a 80% amylopektínu Zdroj: Asociácia škrobárskeho priemyslu xx.xx.2007 44

Priemyselná výroba škrobu (Emslandský škrob) Zemiaky Umývanie zemiakov Strúhadlo Dekantér Reverzná osmóza Škrob a vláknina Vysoký sekundárny prietok bielkovín Separátor (vymytie škrobu) Zemiaková ovocná voda (KFW) Škrob xx.xx.2007 45

Používanie škrobu Technické výrobky (papier, lepidlá, stavebné materiály, textil) Dnes sa v potravinárskom priemysle spracováva 50% kozmetických výrobkov xx.xx.2007 46

Skupina proteázových inhibítorov Proteín Podiel KFW proteínu [%] Molárna hmotnosť [kda] Zemiakový inhibítor I (PI-1) 4,5 7,7-7,9 (39) Zemiakový inhibítor II (PI-2) 22 10, 2 (21) Inhibítor zemiakových aspartylproteáz (PAPI) 6 19,9-22 Inhibítor zemiakových cysteinylproteáz (PCPI) 12 20,1-22,8 Inhibitor zemiakových kunitzových proteáz (PKPI) 4 20,2 Iné inhibítory serínovej proteázy (OSPI) 15 1,5 21 - 21,8 Inhibítor zemiakovej karboxypetidázy (PCPI) 1 4,3 47

Kvalita zemiakového proteínu Vysoká výživná kvalita: 120 obmedzujúca: Tryptofán 100 max. Aminokyselinové skóre (AAS) 80 čisto zeleninový 60 vysoký podiel glutamínu alebo g proteínu] Anfo [mg/g 40 FAO/WHO štandardný zemiakový proteín Emslandský škrob 20 0 FAO/WHO- Odporúčanie (1990): Opravená stráviteľnosť bielkovín AAS = AAS x skutočná stráviteľnosť vo výkaloch Ile Leu Lys Met + Cys Tyr Thr Trp Val Proteínová biologická hodnota stráviteľnosť [%] AAS PDCAAS FAO/WHO/UNU Expert Consultation (1985), Energy and Protein Requirements, Technická správa, séria 724. Svetová zdravotnícka organizácia, Ženevské hovädzie mäso 80 98 0,94 0,92 Vajcia 100 98 100 1,00 100 1,00 Správa zo série 724. Svetové zdravie Kravské mlieko 91 95 1,00 1,00 Sója 74 95 0,96 0,91 Pšenica 64 91 0,47 0,42 Zemiak t 69-100 1,00 - Schaafsma, G. (2000), skóre aminokyselín korigované na stráviteľnosť proteínov. Journal of Nutrition 130, 1865-1867 48

Charakterizácia Q - MALDI MSMS aminokyselinové sekvencie: 1 MATTKSFLIL FFMILATTSS TCAKLEEMVT VLSIDGGGIK GIIPAIILEF 51 LEGQLQEVDN NKDARLADYF DVIGGTSTGG LLTAMITTPN ENNRPFAAAK 101 DIVPFYFEHG PHIFNYSGSI LGPMYDGKYL LQVLQEKLGE TRVHQALTEV 151 AISSFDIKTN KPVIFTKSNL AKSPELDAKM YDICYSTAAA PIYFPPHHFV 201 THTSNGARYE FNLVDGAVAT VGDPALLSLS VATRLAQEDP AFSSIKSLDY 251 KQMLLLSLGT GTNSEFDKTY TAEEAAKWGP LRWMLAIQQM TNAASSYMTD 301 YYISTVFQAR HSQNNYLRVQ ENALNGTTTE MDDASEANME LLVQVGETLL 351 KKPVSKDSPE TYEEALKRFA KLLSDRKKLR ANKASH Tryptická digescia poskytuje peptidové hmoty, ktoré zodpovedajú teoretickej digescii Jasná identifikácia patatínu prostredníctvom porovnania databázy xx.xx.2007 49

Charakterizácia S-frakcie - MALDI-MSMS Intenzita [%] 100 80 60 40 S 75 frakcia

4300 Da Kunitzov inhibítor (približne 20 kda) Inhibítor karboxypeptidázy (približne 4300 Da) frakcia S 75

20305 Da 20 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 m/z xx.xx.2007 50

katiónový výmenník aniónový výmenný proteín A His-značka protilátka Con A

pridanie vzorky na zachytávaciu membránu

vzorka katexu 6 vzorka anexu 4 vzorka proteínu A 11 vzorka His-tagu 3 vzorka protilátky 10 Con A vzorka 1

Doska je zostavená z 8-jamkových pruhov

Výhody membránovej technológie Vysoký separačný výkon a kapacita Mierne podmienky procesu možné Konvekčný prenos materiálu, minimalizované obmedzenie difúzie Vysoká priepustnosť, skrátený čas spracovania 62