Diferenciácia buniek

Princíp kolorimetrickej detekcie pomocou p-nitrofenolu. Metabolizmus pNPP na žltý p-nitrofenol pomocou membránovo viazaných alkalických fosfatáz živých buniek.

Test p-nitrofenol fosfátu (test pNPP) ako prvý použil Engvall a kol. (1980) a používa sa na stanovenie stupňa diferenciácie medzi adherentnými a neadherentnými bunkami. pNPP je substrát alkalickej fosfatázy (AP). Po hydrolýze fosfátových zvyškov fosfatázou sa vytvorí p-nitrofenol ako žltý rozpustný konečný produkt. Po ukončení reakcie pridaním roztoku hydroxidu sodného sa môže intenzita zafarbenia určiť kolorimetricky v čítačke ELISA pri vlnovej dĺžke 405 nm. Tvorba žltého produktu je úmerná aktivite alkalickej fosfatázy.

Obrázok vľavo hore.

Princíp fluorometrickej detekcie s fluoresceíndifosfátom (FDP)

Aktivita alkalickej fosfatázy môže byť tiež stanovená fluorimetricky ako miera na hodnotenie stupňa diferenciácie.
V tomto prípade sa namiesto kolorimetrického farbiva p-NPP použije fluórmetrické farbivo fluoresceíndifosfát. Alkalická fosfatáza je schopná uvoľňovať fluoresceín z tejto zlúčeniny, čo sa potom dá merať fluorimetricky (Ex 485nm/Em 538nm) v čítačke viacerých platničiek.

Skúšobné hodnotenie

1. Stanovenie obsahu bielkovín vo vzorke pomocou Bradfordovej skúšky
2. Zmerajte absorbanciu alebo fluorescenciu vzoriek
3. Výpočet ako uM p-NP alebo fluoresceín/min/mg proteínu

Obrázok vpravo hore.

Náklady (kolorimetrický test)

Náklady (fluorometrické)

Príklady použitia

Štúdie o regulácii diferenciačných dejov v kontexte homeostázy buniek a tkanív po doplnení flavonoidov alebo oligosacharidov (Kuntz et al. 2007 a 1999)