Dizertačná práca. na získanie akademického titulu. DR. med. na lekárskej fakulte. univerzity v Lipsku

1 Tkanivové inžinierstvo trojrozmerného srdcového tkaniva pomocou mezenchymálnych kmeňových buniek a histologické vyšetrenie tkaniva na integráciu a bunkovú diferenciáciu na krysom modeli in vivo Dizertačná práca na získanie akademického titulu Dr. med. na Lekárskej fakulte Univerzity v Lipsku Predkladá: Cathleen Spath Dátum narodenia, miesto narodenia:, Bad Frankenhausen Dokončené dňa: Heart Center Leipzig Vedúci: Prof. Dr. med. Uznesenie Stefana Dheina o udelení doktorandského titulu od:

2 Obsah Bibliografický popis Zoznam skratiek v vi 1 Úvod Pozadie Alternatívne typy buniek pre srdcové tkanivové inžinierstvo Charakterizácia MSC Plastickosť MSC Využitie MSC v srdcovej regeneratívnej medicíne Dvojitá úloha MSC pri vývoji nádoru Otázky a ciele Materiály Pomôcky a pomôcky Laboratórne pomôcky Chemikálie a biochemické látky Drogy a Chemikálie pre pokusy na zvieratách Laboratórne zvieratá Bunky Informácie o výrobcovi: cmscs Chemikálie pre histológiu Primárne protilátky Sekundárne protilátky Značené protilátky pre FACS Zloženie média Všeobecné roztoky Roztoky pre histológiu Metódy Použité línie MSC Izolácia mezenchymálnych kmeňových buniek z dospelej kostnej drene potkana (smsc) Anestézia potkanov Izolácia a kultivácia smscs Rozmrazovanie a kultivácia cmcs Subkultivácia dvoch MSC línií Charakterizácia MSC Prietokové cytometrické merania MSC Príprava vzoriek Meranie vzoriek na prietokovom cytometri ii

4 Obsah 5 Diskusia 71 6 Zhrnutie 80 Zoznam obrázkov 82 Zoznam tabuliek 84 Bibliografia 85 Prílohy 99 Vyhlásenie o autonómii 102 Životopis 103 Publikácie 104 Poďakovanie 106 iv

6 Zoznam skratiek AEC AK Aqua dest. BSA BMC BM-MSC BMMNC CaCl 2 2 H 2 O CEE CD CH 2 O cmsc cmsc-et CSC 3-Amino-9-etylkarbazolové protilátky Destilovaná voda Bovínny sérový albumín bunky kostnej drene (nefrakcionované bunky kostnej drene) mezenchymálne kmeňové bunky získané z mononukleárnych buniek kostnej drene bunky (mononukleárne bunky kostnej drene) dihydrát chloridu vápenatého extrakt kuracieho embrya zhluk diferenciácie formaldehyd komerčne získané mezenchymálne kmeňové bunky z kostnej drene potkana Inžinierske tkanivo z cmsc srdcových kmeňových buniek Cx40 Connexin 40 Cx43 Connexin 43 Cx45 Connexin 45 DAPI DMSO EDTA EGF EHT EZM FIT FKS FSC GJIC HCl HE 4,6-diamino-2-fenylindol dimetylsulfoxid etyléndiamíntetraacetát endoteliálny rastový faktor Konštruované srdce Tkanivo Extracelulárna matrica fluorescenčne aktivované bunkové skenovanie (prietokový cytometer) Fluoresceín izotiokyanát fibroblastový rastový faktor fetálne teľacie sérum Medzikontinentálna komunikácia sprostredkovaná kyselinou chlorovodíkovou -Eozín vi

7 Zoznam skratiek IPS bunky indukované pluripotentné kmeňové bunky HPF pole s vysokým výkonom (1 HPF = 0,1734 mm 2) HS IgG KCl Kg KG KH 2 PO 4 konské sérum Imunoglobulín G Chlorid draselný Kilogram telesnej hmotnosti Dihydrogenfosforečnan draselný Klf4 Faktor podobný Kruppel 4 MgCl 2 6 H 2 O MSC MSC-ET NaCl NaH 2 PO 4 2 H 2 O NaOH Na 2 HPO 4 2 H 2 O Hexahydrát chloridu horečnatého mezenchymálne kmeňové bunky Vytvorené tkanivo z mezenchymálnych kmeňových buniek Chlorid sodný Dihydrogenfosforečnan sodný Hydroxid sodný Hydrogénfosforečnan sodný Októbrový väzbový transkripčný faktor 4 P/S PBS RT SEM smsc smsc et penicilín/streptomycín fosfátom pufrovaný soľný roztok izbová teplota štandardná chyba priemerných samostatne izolovaných mezenchymálnych kmeňových buniek z kostnej drene potkana Inžinierske tkanivo zo smsc Oblasť určujúca pohlavie Sox-2 Y (SRY) -box 2 SSC TBS TGFβ TRIS TRITC rpm VEGF vwf strana rozptyl tris pufrovaný soľný roztok transformujúci rastový faktor beta Tris (hydroxymetyl) aminometán tetrametyl Rhodamín izotiokyanát U otáčky za minútu vaskulárny endoteliálny rastový faktor Von Willebrandov faktor vii

16 2 Materiály 2.1 Pomôcky a pomôcky Pomôcky/pomôcky Typ Výrobca Krajina/Mesto Odsávacie zariadenie Bunková kultúra/mikrobiológia NeoLab Heidelberg DE/Heidelberg Autokláv Varioklav 75T HP Medizintechnik GmbH DE/Oberschleißheim Brušný uterák cm NOBA Verbandmittel Danz GmbH & Co. KG Ventilátor ADS 1000 Engler Engineering Corporation Bottle Inkubátor špičkového filtra Chirurgické skalpely na jedno použitie Nalgene FastCap filtračná jednotka na fľašu typu BB 16 a 16 CU Sigma Aldrich und Chemie GmbH Heraeus Instruments GmbH DE/Wetter USA/Hialeah DE/Steinheim DE/Gera BB513, BB511 Aesculap DE/Tuttlingen Tlakové kalibračné zariadenie 367 HSE Produkty NIE/Vkladací stroj Egersund Jednorazové chirurgické zakrytie Tissue Tek Vip E150/E cm Rancodrope Sakura Finetek Europe BV Lohmann & Rauscher GmbH & Co. KG NL/Alphen aan den Rijn DE/Neuwied Jednorázové žiletky Med Compfort AMPri GmbH DE/Stelle Eismaschine 2BE Ziegra-Eismaschinen DE/Isernhagen Elektrický stimulačný prietokový cytometer (FACS) vyrábaný vlastnou lekárskou technológiou Srdcové centrum Lipsko LIP II BD DE/Heidelberg Faden Silk Braplet SMI BE/St. Mikrovlnná váha Vith Waage Sartorius BP210D DE/Göttingen Kamera PowerShot G5 Canon GB/Middlesex Plynomer M-45 Stöckert Instrumente DE/Mníchov 9

19 2 Materiály Zariadenia/Pomôcky Typ Výrobca Krajina/Mesto Tepelná kúpeľ Histológia Typ 24900 Medax Nagel GmbH DE/Kiel Tepelná skrinka M400 Memmert GmbH & Co. KG DE/Schwabach Q-Gard2 EMD Millipore Corporation USA/Billerica Cell Culture Bank Typ HS12 Heraeus Instruments GmbH DE/Gera Centrifuge Megafuge 1.0 R Heraeus Instruments GmbH DE/Gera Tabuľka 2.1: Zariadenia a zdroje. 2.2 Laboratórny riad Laboratórny riad Typ Výrobca Krajina/Mesto Autoklávovacia páska Steri Clin VP-Group DE/Feuchtwangen Krycie sklá mm, mm Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe EHT forma vlastnoručne vyrobená Glasbläserei Kind DE/Leipzig Forma na vkladanie Tissue Tek III Sakura Finetek Europe B.V. Vkladacie kazety K115.1 Carl Roth GmbH & Co. KG Eppendorfove skúmavky 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml Greiner-Bio-One GmbH NL/Alphen aan den Rijn DE/Karlsruhe DE/Frickenhausen Erlenmeyerova banka 2 l Simax US/Systém na úpravu vody Elk Grove Village FACS - tuby s guľatým dnom/BD DE/Heidelberg FACS Flow 20 l, BD DE/Heidelberg Falcontubes 15 ml, 50 ml Greiner Bio-One GmbH DE/Frickenhausen Fettstick Dako Pen Dako GmbH DE/Hamburgská vlhkostná komora Wolfgang Weckert Labortechnik DE/Kitzingenov filter 100 µm 2 BD DE/Heidelberg filtračné papierové sklenené fľaše Tissue Tek II SA ml, 500 ml, 1000 ml Vogel GmbH & Co. KG Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Gießen DE/Karlsruhe 12

21 2 Materiály Laboratórny riad Typ Výrobca Krajina/Mesto Sérolové pipetovacie špičky Injekčné striekačky Vážiace misky 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml 2 ml, 5 ml, 100 ml, 25 ml mm, mm TPP BD Carl Roth GmbH & Co. KG Banky na bunkovú kultúru 75 cm 2 Greiner Bio-One GmbH USA/St. Louis DE/Heidelberg DE/Karlsruhe DE/Frickenhausen Tabuľka 2.2: Laboratórne náradie. 2.3 Chemikálie a biochemické látky Všeobecné chemikálie Typ Výrobca Krajina/Mesto Ethylalkohol denaturovaný, 99,8% Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe HCl 37% Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe Isopropanol Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe KCl Merck KGaA DE/Darmstadt NaCl> 99,5% Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe NaOH> 99% Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe metanol> 99% Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe TRIS> 99% Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe Tabuľka 2.3: Všeobecné chemikálie. Chemikálie pre bunkovú kultúru Typ Výrobca Krajina/Mesto Aqua dest. BSA monohydrát glukózy D + Milli Q Academic System Millipore GmbH Sigma Aldrich und Chemie GmbH DE/Schwalbach DE/Steinheim pre mikrobiológiu Merck KGaA DE/Darmstadt CaCl 2 2 H 2 O Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe 14

22 2 Materiály Chemikálie pre bunkovú kultúru Typ Výrobca Krajina/Mesto HEPES> 99,5% Sigma Aldrich und Chemie GmbH DE/Steinheim KH 2 PO 4> 99,5% Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe MgCl 2 6 H 2 O Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe Na 2 HPO 4 2 H 2 O Merck KGaA DE/Darmstadt NaH 2 PO 4 2 H 2 O Carl Roth GmbH & Co. KG DE/Karlsruhe silikónové lepidlo Dow Corning 734 Dow Corning Corporation USA/Midland Silicone Adhesive Sterile Medtronic World USA/Minneapolis Trypan Blue 0,4% Life Technologies GmbH/Gibco DE/Darmstadt Tabuľka 2.4: Chemikálie pre bunkovú kultúru. Kultivačné médiá a komponenty EHT Typ Výrobca Krajina/Mesto Adipogenisis Diferenciačná súprava Extrakt z kuracieho embrya Matrigel (extracelulárna matrica) Fetálne teľacie sérum (FCS) A Thermo Fisher Scientific DE/Darmstadt Frozen CE-650-J Sera Laboratories International BD, Merck KGaA/Biochrom GB/Cuckfield DE/Heidelberg DE/Berlínske konské sérum Thermo Fisher Scientific DE/Darmstadt Kollagen chvost potkana typu I Sigma Aldrich und Chemie GmbH DE/Steinheim Kollagenase Type II Merck KGaA/Biochrom DE/Berlin M199 1-násobné Thermo Fisher Scientific DE/Darmstadt M199 2-násobok Thermo Fisher Scientific DE/Darmstadtský penicilín/streptomycín 5 000 IU/ml penicilínu, 5 000 µg/ml streptomycínu Thermo Fisher Scientific DE/Darmstadt Tabuľka 2.5: Kultivačné médiá a komponenty EHT. 15