Zložky potravy a ich vplyv na patogenézu autoimunitného diabetu u ľudí a myší

TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN Predseda fyziológie výživy Nutričné zložky a ich vplyv na patogenézu autoimunitného diabetu u ľudí a myší Daniela Bettina Müller Kompletná kópia dizertačnej práce schválenej Vedeckým centrom pre výživu, využitie pôdy a životné prostredie Technickej univerzity v Mníchove Weihenstephan na získanie akademického titulu schválenej dizertačnej práce. Doktor vied o domácnosti a výžive predseda: skúšajúci dizertačnej práce: Univ.-Prof. DR. J. J. Hauner 1. Univ.-Prof. DR. H. Daniel, 2. aplikácia, prof. Dr. A-G. Ziegler Dizertačná práca bola predložená na Technickú univerzitu v Mníchove 5. januára 2010 a prijatá vedeckým strediskom Weihenstephan Science for Nutrition, Land Use and Environment 25. februára 2010.

Za mojich dvoch dedkov

Obsah Obsah 1 Úloha. 1-3 2 Úvod a prehľad literatúry. 4-23 2.1 Základy cukrovky 1. typu. 4 2.1.1 Dôležitosť genetiky. 5-6 2.1.2 Patogenéza a imunologické pozadie cukrovky 1. typu. 6-8 2.2 Pšenica a jej bielkovinové frakcie. 8-9 2.2.1 Celiakia a asociácia medzi cukrovkou typu 1 a celiakiou. 10-14 2.2.2 Vplyv pšeničných bielkovín na vývoj autoimunitného diabetu na zvieracích modeloch. 14 2.2.3 Zvieracie modely cukrovky 1. typu. 14-15 2.2.4 Vplyv stravovacích faktorov na vývoj autoimunitnej cukrovky na zvieracích modeloch. 16 2.3 Kravské mlieko a jeho bielkovinové frakcie. 17 - 18 2.3.1 Vplyv bielkovín kravského mlieka na vývoj autoimunitného diabetu na zvieracích modeloch. 18-19 2.4 Vplyv pšenice a kravského mlieka pri cukrovke typu 1. 19-21 2.5 Asociácia medzi imunitným systémom spojeným s črevom a autoimunitným diabetom. 21 - 22 2.6 Ostatné zložky potravy a ich možná asociácia s cukrovkou 1. typu. 22 - 23 3 Materiál a metódy. 24 - 41 3.1 Vyšetrovanie modelu myši NOD. 24 3.1.1 Myší kolektív. 24 3.1.2 Diéty. 24 - 27 3.1.3 Protokol - čiastočný experiment 1 a 1a. 27-29 3.1.4 Protokol čiastočný experiment 2. 29-30 3.1.5 Protokol čiastočný experiment 3. 31 I.

Obsah Obsah. Zoznam obrázkov. Zoznam tabuliek. Zoznam skratiek. I-V VI-VIII IX-X XI Predchádzajúce publikácie. XII životopis. XIII-XIV vďakyvzdania. XV V

Zoznam obrázkov Obr. 26 Väzba IAA na mlieko, mliečne bielkoviny, umelú výživu a pšenicu v porovnaní s ľudským inzulínom. 74 Obr. 27 Väzbové krivky IAA na zložky potravín. 75 Obr. 28 Väzbové krivky IAA na mliečne bielkoviny. 76 Obr. 29 Väzba IAA na rôzne mliečne bielkoviny v porovnaní s inzulínom (časť 1). 77 Obr. 30 Väzba IAA na rôzne mliečne bielkoviny v porovnaní s inzulínom (časť 2). 78 Obr. 31 Väzba IAA na rôzne mliečne bielkoviny v porovnaní s inzulínom (časť 3). 79 VIII

Zoznam tabuliek Tabuľka 20 Analýza koncentrácie bielkovín v extrahovaných potravinových roztokoch v rôznych zriedeniach a výsledné stredné hodnoty. 66 - 67 Tab. 21 Charakteristiky testovaných osôb, ktorých IAA sa viaže na extrakt sušeného mlieka. 73 X

Zoznam skratiek Zoznam skratiek Obr. Obrázok AK Protilátky Asp asparagín cpm rádioaktívne rozpady za minútu (počet za minútu) GAD (A) (protilátky proti) glutamát dekarboxyláza HLA histokompatibilný komplex (ľudský leukocytový antigén) I (A) A Inzulínová (auto) protilátka IA-2 (A ) (Protilátky proti) proteín tyrozín fosfatáza IA-2 ICA protilátky ostrovčekových buniek Ig imunoglobulín MHC hlavný komplex histokompatibility min. Minúty nb neznáme NOD neobézny diabetický RBA test väzby rádioligandu rpm počet otáčok za minútu T1D diabetes typu 1 Tab. Tabuľka TBST Tris pufrovaný soľný roztok plus Tween TBT Tris pufrovaný Tween t-tg tkanivová tranglutamináza vs. vs. Svetová zdravotnícka organizácia WHO ZnT8 transportér zinku 8 XI

Vedieť stanoviť úlohy, ktoré by sa dali považovať za potenciálne počiatočné cieľové antigény IAA. Celkovo by táto práca mala zistiť možný vplyv jednotlivých zložiek potravy na imunitný proces autoimunitného diabetu. Pomocou údajov získaných in vivo na modeli NOD sa testujú potenciálne diabetogénne zložky potravy na ľudských sérach. Pomocou týchto modelov in vitro sa bude skúmať, do akej miery by sa imunitné udalosti diabetu typu 1 mohli spočiatku vyvolať krížovými reakciami so zložkami potravy. Výsledky týchto experimentov môžu opisovať ďalšie, doteraz neznáme mechanizmy patogenézy cukrovky, a môžu sa teda použiť na vývoj primárnych terapií na prevenciu rozvoja cukrovky 1. typu v ranom detstve. 3

Materiál a metódy (strava D), druhá skupina zostala na strave obsahujúcej pšenicu A a tretia skupina zostala na strave bez pšenice B. Samice mláďat chovnej skupiny bezlepkovej a kazeínovej diéty C boli zaradené do testovacej skupiny pozostávajúcej z veku 9 týždňov. samice zvierat, ktoré zostali na diéte C (pozri obr. 4). Chovné páry Bezlepková diéta obsahujúca kazeín B Bezlepková a kazeínová diéta C Testovacie skupiny Diéta B n = 12 Diéta A n = 12 Diéta D n = 12 Diéta C n = 9 Obr. 4 Pridelenie samíc NOD myší chovným a testovacím skupinám v čiastočnom teste 1. Samce mladých zvierat chovnej skupiny bezlepkovej diéty B sa po laktácii vo veku troch týždňov oddelili od matiek, ako je to opísané pre samice, a rozdelili sa do troch testovacích skupín. Analogicky k zoskupeniu samíc myší jedna zo skupín dostávala referenčnú stravu (diéta D), druhá dostávala stravu obsahujúcu pšenicu A a tretia skupina zostávala na bez pšeničnej diéte B (pozri obr. 4a). Chovné páry bezlepková diéta obsahujúca kazeín B Testovacie skupiny Diéta B n = 11 Diéta A n = 10 Diéta D n = 12 Obr. 4a Pridelenie samčích NOD myší chovným a testovacím skupinám v čiastkovom experimente 1a. 28

Materiál a metódy Na oddelenie proteínových frakcií obsiahnutých v pšenici sa uskutočnila modifikovaná trojstupňová extrakcia, pri ktorej boli v supernatante v prvom kroku extrakcie prítomné albumíny a globulíny, v druhom extrakčnom kroku boli v supernatante obsiahnuté prolamíny (gliadíny) a V poslednom kroku sa gluteníny separovali (Wilson a Goulding 1991, Mimouni a kol. 1998, Nicolas a kol. 1998 Idris a kol. 2003). Extrakcia albumínov z múky a globulínov Centrifugácia> 2x sediment Extrakcia gliadínom Centrifugácia> 3x Glutelínová extrakcia sedimentu (atmosféra N2) Centrifugácia> 2x centrifugácia všetkých supernatantov Zrážanie Skladovanie pri 18 ° C Obr. 7 Schéma extrakcie proteínov a separácia frakcií z pšeničnej múky. Navážilo sa 0,1 g komerčnej pšeničnej múky typu 550, pridal sa 1 ml tlmivého roztoku Sörensen (pH 7,35) a zmes sa trepala pri teplote 4 ° C počas 20 minút. Po centrifugácii (20 minút, 1 000 ot./min., Centrifúga Sorvall RC 5B Superspeed Centrifuge) pri 4 ° C sa supernatant odstránil a sediment sa po pridaní Sorensenovho pufru znova extrahoval rovnakým spôsobom. Dva supernatanty sa spojili a skladovali pri 4 ° C, kým sa nedokončili ďalšie extrakčné kroky. 33

Materiály a metódy Vyzrážali sa komplexy protilátok. Po centrifugácii sa odstránilo 60 ul nadstavby a prenieslo sa do novej skúmavky. Po pridaní 10 ul anti-humánnej IgA agarózy v 40 ul TBT pufru do týchto skúmaviek sa inkubácia uskutočňovala opäť pri 4 ° C po dobu jednej hodiny za trepania. Nasledovali premývacie kroky opísané v bode 3.2.5 pre všetky skúmavky (Protein-G-Sepharose a IgA-agaróza) a meranie v y-počítači. nd 3.3 Štatistika Vyhodnotenie kumulatívneho rizika cukrovky a frekvencie cukrovky v modeli NOD sa uskutočnilo pomocou analýz prežitia. Test log-rank bol použitý na porovnanie rôznych skupín v modeli NOD. Porovnania skóre inzulínu a prevalencie protilátok medzi skupinami v modeli NOD sa uskutočňovali pomocou neparametrického Mann-Whitneyho U testu. Korelácia medzi relatívnou väzbou IAA na kurací inzulín a afinitami k IAA sa stanovila pomocou Spearmanovej korelácie. Afinity medzi jednotlivými skupinami sa porovnávali pomocou Mann-Whitneyho U testu. Vo všetkých analýzach boli hodnoty p