Bunkové účinky, mechanizmy účinku a detekčné metódy hormónov štítnej žľazy a ich metabolitov

Bunkové účinky, mechanizmy pôsobenia a detekčné metódy hormónov štítnej žľazy a ich metabolitov Dizertačná práca na získanie akademického titulu doctor rerum naturalium (Dr. rer. Nat.) V odbore biológia predložila tropologická vedkyňa Ina Lehmphul, profesorka tropológie Ina Lehmphul na Biologickú fakultu Humboldtovej univerzity v Berlíne. Humboldtova univerzita v Berlíne prof. Dr. Jan Hendrik Olbertz dekan Fakulty biologických vied prof. Dr. Richard Lucius Recenzent: 1. Prof. Dr. Werner Kloas 2. Prof. Dr. Josef Köhrle 3. Prof. Dr. Jens Mittag Deň ústnej skúšky: 23. mája 2015

Obsah Obsah. I Zoznam skratiek. V Zoznam obrázkov. X Zoznam tabuliek. Zhrnutie XI. XII abstrakt. XIII 1. Úvod. 1 1.1 Štítna žľaza. 1 1,2 Hormóny štítnej žľazy (TH). 1 1.2.1 Biosyntéza. 1 1.2.2 Uvoľnenie a preprava. 3 1.3 Hypotalamus - hypofýza - os štítnej žľazy (HPT). 4 1.4 Metabolizmus hormónov štítnej žľazy. 4 1.4.1 Metabolizmus hormónov štítnej žľazy deiodázami. 4 1.4.2 Alternatívny metabolizmus TH. 6 1.4.3 Lokálne a systémové účinky aktívneho TH T 3. 7 1.5 Dôležité TH metabolity 3,5 T. 9 2 1,5.1 Lokálne a systémové účinky 3,5 T 2. 9 1.5.2 Transport v sére a v cieľových bunkách . 10 1.5.3 TH metabolitové receptory. 10 1.5.4 Metódy detekcie pre 3,5 T 2. 11 1.6 Dôležité TH Metabolity 3 T AM. 12 1 1.6.1 Lokálne a systémové účinky 3 T 1 AM. 1.6.2 Transport v sére a do cieľovej bunky. 13 1.6.3 Receptory metabolitov TH. 13 1.6.4 Metódy detekcie metabolitu. 14 1.7 Dôležité TH Metabolity TA 1 3 Kyselina tyroctová. 14 2. Cieľ práce. 17 2.1 Metóda detekcie metabolitov hormónov štítnej žľazy. 17 2.2 Účinok metabolitov hormónov štítnej žľazy v modeli bunkových kultúr. 17 3. Materiál. 18 3.1 Chemikálie. 18 3.2 Zariadenia. 18 I.

3.3 Spotrebný materiál. 18 3.3.1 Súpravy reagencií. 18 3.3.2 Pufre a roztoky. 19 3.4 Databázy. 20 3.5 Softvér. 20 4. Metódy. 23 4.1 Molekulárne biologické metódy. 23 4.1.1 Izolácia RNA trizolom. 23 4.1.2 syntéza cdna. 23 4.1.3 qpcr. 24 4.1.4 Priméry. 25 4.2 Proteínové biochemické metódy. 28 4.2.1 Bradfordov princíp. 28 4.2.2 Bradfordská implementácia. 28 4.3 Bunková kultúra. 4.3.1 Myšia pankreatická bunková línia MIN6. 4.3.2 Ľudská hepatocelulárna bunková línia HepG2. 29 4.4 Testy cytotoxicity/životaschopnosti buniek. 29 4.4.1 Test MTT Test toxicity na bunkách závislý od NADPH. 4.4.1 a) Princíp testu. 29 4.4.1 b) Implementácia. 30 4.4.2 Stanovenie životaschopnosti buniek ATP. 4.4.2 a) Princíp testu. 30 4.4.2 b) Implementácia. 30 4.5 Bunková absorpcia/väzba na povrch bunky 3 T 1 AM. 30 4.6 Extrakcia buniek MIN6 pre LC MS/MS analýzu. 31 4.7 Extrakcia supernatantov bunkových kultúr MIN6 pre LC MS/MS analýzu. 32 4,8 LC MS/MS parametre. 4.8.8.1 AbSciex 4000 analýza bunkových kultúr bunkových lyzátov. 4.8.8.2 AbSciex 6500 analýza supernatantov bunkových kultúr. 34 4.9 Vylučovanie inzulínu stimulované glukózou (GSIS). 36 4.10 Analýza premeny energie špecifickej pre substrát s bioanalyzátorom Seahorse XF. 36 4.10.1 Princíp merania. 36 4.10.1 a) Mitochondriálne dýchanie. 37 4.10.1 b) Glykolýza/metabolizmus substrátu. 39 II

Zoznam skratiek C Stupne Celzia µ mikro µg mikrogramov µl mikroliter µm mikromolárne 2 DG 2 deoxyglukóza 3 T 1 AM 3 jódtyronamín AADC aromatická L aminokyselinová dekarboxyláza Obr. Obrázok AC adenylátcykláza Adra 2α adrenergný receptor 2alfa ANO1 anoktamín 1 AO amínoxidáza Hmotnostný index BSA hovädzí sérový albumín cdna doplnková DNA CLIA Chemilumineszenez Immunoassay Ct cyklus zadržania COX cytochróm C oxidáza DC dekarboxyláza Dehal dehalogenáza DEPC dietylpyrokarbonát diodeiodáza DIT 3,5 diiodtyrozín DMELdifxdifondifón dxifón Miera extracelulárneho acidifikácie duálnej oxidázy ECAR V

EDC ELISA ERK EST FBS FCCP Etyl 3 (3 dimetylaminopropyl) karbodiimid spojený s enzýmom imunotest extracelulárne regulovaná kináza exprimované sekvenčné štítky fetálne hovädzie sérum karbonylkyanid p trifluórmetoxyfenylhydrazón ft 3/ft 4 voľný/neproteínovo viazaný T 3/T 4 GPLC fwd g GaM FCR FPLC fw h H 2OH 2 O 2 HbA 1 c HPLC HPRT HPT os HRP icv Ig i.p. Ipro i.v. kda KRBH Lat/LAT LCB LC MS/MS LDL m M mab rýchla výkonná kvapalinová chromatografia vpred akcelerácia anti-myšací IgG, Fc špecifický a biotinylovaný receptor spojený s G proteínom glukóza stimulovaná sekrécia inzulínu hodina voda peroxid vodíka glykohemoglobín vysokoúčinná kvapalinová chromatografia hypoxantín guanín fosfor žľazové komory hypofýzové ventrikulá hypofyzárne ventrikulá hypofyzárne ventrikulárne hypofýzy intraperitoneálny iproniazid intravenózne kilodalton Krebs Ringer tlmivý roztok HEPES transportér aminokyselín L krížový tlmivý roztok kvapalinová chromatografia spojená tandemová hmotnostná spektrometria lipoproteín s nízkou hustotou milli molárna monoklonálna protilátka VI

MAPK Mct/MCT min MIN6 S MTT mrna n NA NADH NADPH NaN 3 ND NEAA ng NIS nm nm NQ ns Ntcp/NTCP NTI Oatp/OATP OCR ON p pab PAI PB PBS PBST PCR PI3K POAF qpcr transportér proteínu aktivovaný mitogénom monokarboxylátový transportér Bunková línia myš 3 monoódo tyrozín tetrazoliová soľ messengerrna nano neanalyzované nikotínamid adenín dinukleotid fosfát azid sodný nezistené neesenciálne aminokyseliny nanogram jodid sodný nanometrálny roztok nekvantifikovaný kyslíkatý kysličník fosforečný Soľný roztok Fosfátom pufrovaný soľný roztok s Tween polymerázovou reťazovou reakciou Fosfatidyl inozitol 3 kináza pooperačná predsieňová (srdcová) fibrilácia kvantitatívna real time PCR VII

rev RIA RNA rpm RQ rt 3 s.c. SD SDS sec LODE SLC/SLC SULT T 0 T 1 T 2 T 3 T 4 TA TAE TAM TAAR TBG TCA Tg TH TBME TPO TRα TRβ TRE TRH TSH reverzná rádioimunologická skúška Revolúcie ribonukleovej kyseliny/min respiračný kvocient reverzný 3,3,5 trijód L tyronín subkutánna štítna žľaza dodecylsulfát sodný druhá Štúdia zdravia v Pomoransku solutovaný nosič sulfotransferáza tyronín 3/3 tyronín 3,5/3,3/3,5 dijód L tyronín 3,3,5 trijód L tyronín 3,3,5,5 tetraodín L tyronín/tyroxín Thyroacetic kyselina Tris-acetát EDTA pufra Thyronamine stopa amin receptor spojený tyroxín viažuci globulín trikarboxylová tyreoglobulínu thyronin, hormóny štítnej žľazy terc Butylmetyléter štítnej peroxidáza receptora thyroidného hormónu a-receptor hormónu štítnej žľazy 3/beta TH prvok reagujúci thyreotropin uvoľňujúci hormón 3/beta TH prvok reagujúci thyrotropin uvoľňujúci hormón 4/beta TH reagujúce proteín 4 thyrotropin uvoľňujúci hormón 4/beta-TH reagujúce proteín 4 thyrotropin uvoľňujúci hormón 4/beta-throid stimulujúci proteín 4 thyrotropin uvoľňujúci hormón 4/beta-TH reagujúce proteín Transtyretín VIII

VLDL obj.% Lipoproteínu veľmi nízkej hustoty obj. IX

Transportný mechanizmus do cieľovej bunky je známy a aktivácia receptorov planárnej membrány sa musí ešte preskúmať. 16

Tabuľka 2 Bežne používané reagenčné súpravy Súprava reagencií Absolútna qpcr SYBR Green Mix Bio Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay RQ1 RNase free DNAse ImmunoPure MAb izotyping kit Insulin (myš) ultrasensitive ELISA iscript Select cdna Synthesis Kit LowCross Buffer Pierce Micro BCA Sada na testovanie proteínov PIERCE EZ Link Plus aktivovaná peroxidáza PIERCE SuperSignal ELISA Femto maximálna citlivosť Substrát RIA rt 3 sefaróza r Proteín A diapozitív A lyzačné dialyzačné kazety 2K MWCO ThermoScript reverzná transkriptáza Trizol Výrobca Abgene (Epsom, UK) Bio Rad Laboratories (Mníchov) Prome WI, USA) Promega (Madison, WI, USA) Pierce Chemical Co. (Rockford, IL, USA) Diagnostika DRG (Marburg) Bio Rad (Mníchov) Candor Biosciences (Wangen) Thermo Scientific (Waltham, MA, USA) Thermo Scientific ( Waltham, MA, USA) Thermo Scientific (Waltham, MA, USA) ZenTech SA (Belgicko) GE Healthcare (Freiburg) Pierce Chemical Co. (Rockford, IL, USA) Invitrogen (Karlsruhe) Thermo Scientific (Waltham, MA, USA) 3.4 Databázy Tabuľka 4 zobrazuje všetky použité systémy riadenia údajov. 3.5 Softvér Tabuľka 5 sumarizuje softvér použitý v tejto práci. 20