Klonovanie

Čo tak váš klon? Niekto, kto ráno vstane a pôjde za vami do školy, urobí si domáce úlohy a urobí poriadok v miestnosti, aby ste mali dostatok času na kino? Skvelý nápad, alebo možno nie?

4. Nástroje génového klonovania

Vedci používajú na klonovanie rôzne molekulárne nástroje. Reštrikčné enzýmy (presnejšie reštrikčné endonukleázy), ktoré dokážu rozpoznať a rozrezať DNA v určitých polohách, sú nevyhnutné. Reštrikčné enzýmy sa nachádzajú v baktériách a sú porovnateľné s strážnymi psami: Chráni baktérie pred inváziou vírusov. Reštrikčné enzýmy rozpoznávajú vírusovú DNA a rozkladajú ju v procese nazývanom reštrikcia. Reštrikčné enzýmy môžu rozlišovať medzi vašou a cudzou DNA, pretože vaša vlastná DNA je chemicky označená metylovou skupinou, ktorá funguje ako vlajka. Cudzia DNA však túto vlajku nenesie.

Reštrikčné enzýmy fungujú mimoriadne špecificky: Rozoznávajú krátke sekvencie DNA a v tomto okamihu prerezávajú vlákno DNA. Reštrikčný enzým, ktorý výskumníci často používajú pri pokusoch, sa nazýva Eco RI, prvý reštrikčný enzým, ktorý sa objavil v baktérii Escherichia coli (E. coli). Rozpoznáva a reže sekvenciu GAATTC a zanecháva po sebe takzvané lepivé konce (pozri filmovú sekvenciu „Technológia rekombinantnej DNA“). Takto vytvorené kúsky DNA (fragmenty) je možné navzájom relatívne ľahko spojiť (pozri obrázok 2.1).

Okrem reštrikčných enzýmov sú ďalším nástrojom na klonovanie plazmidy. Plazmidy sú „génové taxíky“: môžu absorbovať cudziu DNA a preniesť ju na baktérie. Baktérie, napríklad E. coli, potom prevezmú produkciu génov a proteínov. Baktérie E. coli sú hlavnými testovacími organizmami v mnohých laboratóriách a sú najviac preskúmanými živými organizmami.

Aby klonovanie fungovalo, používajú vedci trik: Použité plazmidy majú tiež gén, ktorý dodáva baktériám, ktoré požierajú plazmidy, rezistenciu na antibiotikum ampicilín. Tento odpor sa neskôr ukáže ako dôležitý.

V našom experimente reštrikčný enzým Eco RI štiepi ľudskú DNA, ktorú sme získali zo vzorky slín. Tak vzniknú tisíce kúskov DNA - jedna z nich obsahuje inzulínový gén, ktorý hľadáme. Na rezanie bakteriálnych plazmidov používame rovnaké enzýmy. Kvôli lepivým koncom môžeme jednotlivé kúsky spojiť. Mnoho plazmidov nezachytí nič, veľa zachytí ľudskú DNA a niekoľko zachytí inzulínový gén, ktorý hľadajú. Všetky plazmidy sa potom zavedú do baktérie E. coli.

Teraz distribuujeme všetky baktérie na platňu s živným médiom, na ktorom baktérie v zásade nemôžu rásť, pretože platňa obsahuje antibiotikum ampicilín. V tomto kroku sa pšenica oddelí od plev: Všetky baktérie, ktoré pohltili plazmid, môžu rásť na platni a vytvárať kolóniu, pretože plazmid ich robí rezistentnými na ampicilín. Baktérie sa množia a s nimi požadovaný gén pre inzulín.

V tomto okamihu sme naklonovali tisíce kúskov ľudskej DNA, nielen tých, ktoré nás zaujímajú. Ďalší krok, skríning všetkých kolónií, je veľmi časovo náročný.

Ako môžeme nájsť toho, kto nesie náš inzulínový gén zo všetkých tisícov klonov? Ak už poznáme časť sekvencie DNA inzulínového génu, môžeme vyprodukovať kúsok mRNA dlhý asi 30 párov báz, ktorý sa pripojí na sekvenciu inzulínového génu ako sonda. Táto sonda je rádioaktívna alebo označená fluorescenciou, aby sme mohli určiť, ku ktorým klonom sa dokuje. Vďaka tejto sonde nájdeme klon, ktorý obsahuje náš inzulínový gén (pozri obrázok 2.2). Pomocou tejto techniky je možné klonovať mnoho ďalších génov, napríklad pre rastové hormóny a interferón, génové produkty, ktoré sa tiež používajú ako lieky.

Týmto je klonovanie génov úspešne dokončené a je zrejmé, prečo sa používajú baktérie, a nie vyššie organizmy: vyššie organizmy sa množia sexuálne. Pre tieto živé bytosti má sexualita výhodu v tom, že sa genetická výbava rekombinuje a že z nej vychádzajú noví jedinci s novými vlastnosťami. To vytvára evolučné výhody. Pre vedcov je však táto nová genetická kombinácia rušivá, pretože by mohla zmeniť aj gén pre inzulín.

Vedci musia pracovať so zvieratami, ktoré sú geneticky identické: iba klony v experimente reagujú vždy rovnako. Ak chcú vedci otestovať drogu, vždy používajú myši rovnakého kmeňa. Takéto myšie kmene sa chovajú pomocou kríženia alebo sa navzájom krížia blízke zvieratá.