University Medical Center Hamburg - Eppendorf

University Medical Center Hamburg - Eppendorf Center for Experimental Medicine Institute for Molecular Cell Biology Riaditeľ: Prof. Dr. rer. Physiol. DR. H. c. Ulrike Beisiegel O mechanizme hepatomegálie pri chorobách z preťaženia železom. Vyšetrovanie génovej expresie na zvieracom modeli potkana Dizertačná práca na získanie titulu DOCTOR MEDICINAE lekárskej fakulty univerzity v Hamburgu v Hamburgu - Eppendorf, ktorú predložil: Ehsan Khaljani narodený v Teheráne/Irán Hamburg 2010

Prijaté lekárskou fakultou dňa: 25.10.2010 Publikované so súhlasom lekárskej fakulty univerzity v Hamburgu Vedecký dozor: PD Dr. DR. Peter Nielsen Výbor pre audit, predseda: Prof. Dr. DR. Skúšobná komisia Ulrieke Beisiegel: 2. recenzent: PD Dr. DR. Peter Nielsen Skúšobná komisia: 3. Recenzent: Prof. Dr. R. Böger - 1 -

Obsah 1. Úvod Metabolizmus železa 5 Lekársky význam železa 12 Pečeň: funkcia a fyziológia 16 Zväčšenie pečene 17 Popis zvieracieho modelu a význam skupiny tukov 18 Princíp preťaženia železom TMH Ferrozen 19 Histológia 20 Zmeny génovej expresie na zvieracom modeli potkana 20 Otázka 27 2. Pokusy (materiál a metódy) Sonografické vyšetrenie objemu pečene 28 In vivo stanovenie koncentrácie železa v pečeni pomocou SQUID 29 Štatistické vyhodnotenie údajov o pacientovi 30 Model zvieracieho potkana s TMH ferrozen 32 Odstránenie pečene 33 Stanovenie koncentrácie železa v pečeni potkana in vitro 34 Histologické spracovanie potkaních pečene 35 Izolácia DNA, proteínov a RNA pre rt rt PCR 36 RNA gélová elektroforéza 38 Transkripcia RNA v cdna 40 Generovanie a usporiadanie primérov 41 Vykonanie rt rt PCR 44 Štatistické vyhodnotenie údajov rt rt PCR 45 DNA gélová elektroforéza 49 Vykonanie Western blotov s p-act 5 0-3 -

3. Výsledky Štatistické vyhodnotenie údajov o pacientovi 51 Objem pečene potkana 53 Stanovenie koncentrácie železa v pečeni potkana in vitro 54 Histologické spracovanie pečene potkana 55 Hmotnosti pečene potkana 56 Vyhodnotenie RT RT PCR a výsledky Western blotu 57 DNA gélová elektroforéza 68 4. Diskusia Diskusia o údajoch o pacientovi 69 Diskusia o Histológia 70 Diskusia o údajoch rt rt PCR a Western blotoch 71 Záver 77 5. Zhrnutie 80 6. Zoznam skratiek 82 7. Zdroje a odkazy 83 8. Príloha (doplnky) rt rt PCR krivky 88 DNA gélová elektroforéza 88 Všeobecný kŕmny súbor 92 9. Poďakovanie 93 10. CV 94 11. Čestné vyhlásenie 96-4 -

Obr.2 Železo vstupuje do tela dvoma spôsobmi. Buď prostredníctvom HCP1 vo forme hemu, alebo ako redukované rastlinné železo prostredníctvom DMT1. Pomocou hemu oxygenázy sa železo zbaví hemu. Podľa Donovana a kol. (Physiology 21: 115-123,2006) je tu konvertovaný späť do svojej trojmocnej formy Hephaestinom, ferooxidázou obsahujúcou meď, za účelom zmeny jej rozpustnosti a nakoniec naviazaný na transferín, privedený na miesto určenia (11). Obrázok 3: Poloha hefaestínu na bazolaterálnej stene enterocytov. To je miesto, kde sa železo premieňa na svoju trojmocnú formu a viaže sa na transferín. Mutácia ferroportínu v autozomálne dominantnej hemochromatóze: strata funkcie, porozumenie, Fleming a kol. (2001) - 7 -

To isté platí aj pre transferínový receptor. Obr. 6 Regulačné proteíny železa sa viažu na 3 - koniec mRNA receptora pre transferín na charakteristickú štruktúru kmeňovej slučky a zaisťujú tak znížený rozklad mrna (malá degradácia). Podľa Sanchez et al (2006) Týmto mechanizmom je železo zabudované do klastra železo-síra IRP1 (IRP1 sa oddeľuje od IRE), takže absorpcia železa je znížená v dôsledku zníženej expresie DMT1 a vyššie opísaný cyklus môže začať znova . Uvedená regulácia sa však môže uskutočniť aj na 5 nepreloženom konci mrny, kde je možné pozorovať opačný efekt, t. J. Obmedzenie prekladu (21,22). Obr. 7 IRP sa viažu na 5 koniec feritínovej mRNA a bránia tak translácii mrna. Podľa Sanchez et al (2006) - 10 -

Medzitým je známych veľa génov nesúcich motívy IRE, ktoré je možné dokonca úspešne biochemicky identifikovať bez použitia polí. Biokompulačný znamená záznam motívov pomocou špeciálneho počítačového vyhľadávacieho softvéru založeného na známych mrna sekvenciách v PubMed. Obr. 8 Reprezentácia génov nesúcich IRE, ktoré boli identifikované biokompulačne. Regulácia železa a bunkový cyklus, M Sanchez a kol., J Biol Chem. 2006 Aug 11; 281 (32): 22865-74. Epub 2006 Jun 7 Potom, čo je absorbované železo transportované do cieľovej bunky transferínom, je železo uložené vo feritíne ako polymérny oxid-hydroxid-fosforečnan železitý. Obr.9 Tento obrázok feritínu produkovaného röntgenovou kryštalografiou ukazuje ukladanie minerálneho železa v strede feritínového jadra (hnedé). Podľa Casidy a kol. 2004 Feritín je schopný uvoľňovať železo z zásob alebo v ňom pokračovať, v závislosti od potrieb organizmu. - 11 -

Obr.11: Princíp peroxidácie lipidov a jej dôsledky Podľa Nielsena a kol. (2006) je známych mnoho ďalších klinických obrazov v súvislosti s preťažením železom, aj keď závažnosť symptómov závisí od príslušnej genetickej variácie. Myokardiocyty ukladajú železo, čo vedie k toxickej fibróze myokardu. V pankrease môže hemochromatóza viesť k fibróze pankreasu s pluriglandulárnou nedostatočnosťou, čo môže mať za následok sekundárny diabetes mellitus. Toto sa tiež nazýva bronzový diabetes kvôli existujúcej nadmernej pigmentácii kože. V kostnej dreni možno často diagnostikovať siderózu plazmatických buniek, ktorá je charakterizovaná hrubým intralyzozomálnym ukladaním železa v blízkosti jadra (28). Nánosy železa sú vo všetkých prípadoch zistiteľné podľa klasickej pruskej modrej farby. Hemochromatóza chorobného komplexu je rozdelená do štyroch podformulárov. Príznaky a závažnosť sú rôzne. Hemochromatóza typu 1 je najbežnejšou pod formou v západnom svete (29) a je tiež predmetom štúdií pacientov v tejto dizertačnej práci. - 14 -

Železo v pečeni (mg/g hmotnosti pečene) 35 30 25 20 15 10 5 0 Koncentrácia železa v pečeni s TMH-Ferrozen-kŕmenie H mochromatóza 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 doba kŕmenia v týždňoch Obr. 14 Obrázok ukazuje priebeh ukladania železa v pečeni v mg/g hmotnosti pečene vo vzťahu k dĺžke kŕmenia. So zvyšujúcou sa dobou kŕmenia sa dosahuje plató v množstve železa v pečeni. Nielsen 2006 1.7. Histológia Predchádzajúce výskumy zatiaľ nedokázali objasniť, či boli pečene zväčšené preťažením železom u potkanov hypertrofované alebo či zväčšili objem v dôsledku proliferácie. Zatiaľ nie je vylúčený ani zápal. 1.8. Zmeny génovej expresie na zvieracom modeli potkana Na základe predpokladu, že preťaženie železom a tukmi by viedlo k zmenám v génovej expresii, bola skúmaná transkripcia reprezentatívnych markerov pre príslušné metabolické cesty (obrázok 15), ktorá bude podrobnejšie diskutovaná nižšie. Obr.15 Pečeň v strede rôznych metabolických procesov - 20 -

Obr. 17 IGF-1 ako súčasť osi hypotalamus-hypofýza pečeň-kosť. IGF-1 je priamo ovplyvnený rastovým hormónom a je sprostredkovateľom hypertrofie. Zdroj: http://www.mfi.ku.dk Nosné proteíny (IGF-BP 1-6 = inzulín podobný rastový faktor - väzbový proteín) sa viažu na plazmu po vylučovaní IGF-1 a sú tiež pod rastovým hormónom. a kontrola inzulínu. Tieto hormóny určujú, kedy sa IGF1 môže odtrhnúť od svojich väzobných proteínov, prejsť na aktívnu formu a nakoniec sa viazať na svoj receptor (IGF-R = receptor podobný rastovému faktoru podobný inzulínu). Svojou štruktúrou tetraméru a aktivitou intracelulárnej tyrozínkinázy sa IGF-R podobá na inzulínový receptor a umožňuje IGF-1 iniciovať intracelulárne signálne kaskády. Výsledkom signálnej sekvencie je potom zvýšená biosyntéza proteínov, inhibícia proteolýzy, inkorporácia tymidínov do DNA a inkorporácia sulfátov v proteoglykánoch (24). Vplyv markerov hypertrofie sa sledoval aj na úrovni proteínov. Fosforylácia AKT-1 sa zvažovala pomocou Western blotov. - 24 -

Obrázok 18 IGF-1 a signálna dráha AKT priamo súvisia v antiapoptotických dráhach. Zdroj: www.biocarta.com, upravené z Khaljani 2008 AKT-1 je proteínkináza pre rôzne signálne kaskádové dráhy (ako je apoptóza, procesy bunkového cyklu, anigiogenéza), ale AKT-1 priamo súvisí s IGF-1. AKT-1 teda sprostredkuje antiapoptotický účinok IGF-1 jeho zvýšením. Hypertrofiu bez zvýšeného AKT-1 možno do značnej miery vylúčiť, pretože je tiež centrálnym sprostredkovateľom v dráhach hypertrofie. Stále je potrebné brať do úvahy rôzne faktory ovplyvňujúce železo na ACT, pretože železo ako škodlivé činidlo ovplyvňuje rôzne metabolické cesty. Gény zápalu Nadmerný rast buniek môže mať iné príčiny ako proliferáciu a hypertrofiu. V tejto súvislosti je možné zväčšenie pečene v priebehu zápalového procesu, čo sme chceli pozorovať sledovaním markerov zápalu. Prozápalovým markerom, ktorý je klasicky citovaný v literatúre, je TNF-a (tumor nekrotizujúci faktor-a), ktorý sme preto vybrali aj pre našu štúdiu. - 25 -

1.9. Otázka V tejto štúdii je potrebné odpovedať na tieto otázky: 1. Vedie preťaženie železom k hepatomegálii u ľudí, rovnako ako u potkanov? 2. Závisí prípadné zväčšenie pečene u pacientov priamo od koncentrácie železa v pečeni? 3. Ktoré gény zohrávajú úlohu pri zväčšovaní pečene vyvolanom železom u potkanov: proliferácia, hypertrofia alebo zápal a čo ukazuje histológia? 4. Spôsobuje preťaženie železom a tukmi podobné reakcie na úrovni génov a bielkovín? - 27 -

2. Pokusy (materiál a metódy) 2.1. Sonografické vyšetrenie objemu pečene Materiál: - Ultrazvukové zariadenie: Picker CS 9500 - Ultrazvukový kontaktný gél: Caesar a Loritz - Vákuový matrac: Vac Fix As - Pohyblivý gauč Na stanovenie objemu pečene ležali pacienti na chrbte, aby bola pečeň pod pobrežnou klenbou ľahko dosiahnuteľná zisk. Potom sa pomocou salotu ultrazvuku pod laserovou kontrolou vo vzdialenosti 2 cm vytvorili v sagitálnej rovine ultrazvukové obrazy. Oblasť pečene musela byť na obrázkoch označená manuálne a vynásobená hrúbkou plátku 2 cm. Po spočítaní výsledkov 8 rezov bolo objem pečene približný. Práce boli vykonané s láskavou podporou pánov Rainera Engelhardta a Rolanda Fischera z kliniky metabolizmu železa Centra pre ženskú a detskú medicínu, Kliniky a polikliniky pre detskú hematológiu a onkológiu, Univerzitná nemocnica Eppendorf. Obr. 19 Výpis zo spisu pacienta. Je zaznamenané identifikačné číslo (ID), pohlavie (pohlavie), hemochromatózová mutácia (C282Y, H63D), diagnóza, hmotnosť, výška a tiež nameraný objem pečene (Vol-liv) a koncentrácia železa v pečeni (LIC) - 28 -

Gs a (alfa podjednotka stimulujúceho G proteínu) sa tiež pôvodne merala, čo ukázalo porovnateľné údaje. Ukázalo sa však, že GAPDH je v praktickej práci spoľahlivejší, takže expresia cieľových génov súvisela s GAPDH. 3.7. Elektroforéza na géli DNA Fotografie gélov DNA nájdete v prílohe. Obrázky sa používajú na kontrolu RT PCR na prítomnosť nežiaducich vedľajších produktov a kontaminácie. DNA gél sa môže použiť aj na určenie, či má očakávaný produkt zodpovedajúcu veľkosť, čo sa dá skontrolovať pomocou 100 bp rebríka na ľavej strane obrázka. Prvý, dolný pás rebríka predstavuje 100 bp, druhý 200 bp atď. Pretože sa použili iba priméry, ktoré v testovacom cykle vykazovali v géli čisté produkty PCR, na všetkých gélových obrázkoch na príslušnej úrovni je viditeľný iba jeden číry pás. Množstvo závisí od veľkosti amplifikovanej DNA, ktorá je uvedená v zozname primerov. Kontrola PCR ukazuje správnu veľkosť produktu PCR na všetkých obrázkoch a je negatívna z hľadiska kontaminácie. - 68 -