Dizertačná práca. získať akademický titul doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vo vedeckej disciplíne nutričná veda

Institute for Nutrition Science Young Investigator Group Dietary Fibre and Metabolic Syndrome of the German Institute for Nutrition Research Potsdam-Rehbrücke The vplyv diétnych sójových izoflavónov na metabolizmus homocysteínu a funkciu endotelu u zdravých postmenopauzálnych žien Dizertačná práca na získanie akademického titulu doctor rerum naturalium (Dr. rer. Nat.) vo vedeckej disciplíne vedy o výžive podaná Manji Reimannovej na Fakultu matematiky a prírodných vied Univerzity v Postupime narodená 10. apríla 1975 Postupim, august 2005

Nehovorte, že je prihrávka nepriechodná; ak pôjdete hore, môžete ju prejsť. Nehovor, že je to ďaleko, nemôžeš to zniesť; Kto ide, dorazí tiež. Mongolský

Obsah I OBSAH Zoznam tabuliek. IV Zoznam obrázkov. V skratky. VI 1 zhrnutie. 1 2 Abstrakt. 2 3 Úvod. 3 4 Základy. 5 4.1 Artérioskleróza. 5 4.1.1 Epidemiológia. 5 4.1.2 Patogenéza. 5 4.1.3 Účinky estrogénu v kardiovaskulárnom systéme. 4.1.3.1 Farmakológia, estrogénový receptor a mechanizmy účinku. 7 4.1.3.2 Hormonálna substitučná liečba. 4.1.3.3 Hormonálna substitučná liečba a kardiovaskulárne choroby: pozorovacie štúdie. 4.1.3.4 Štúdie na ľuďoch. 10 4.1.3.5 Kardioprotektívne mechanizmy estrogénu. 11 4.1.3.5.1 Artérioskleróza a vaskulárna reaktivita. 11 4.1.3.5.2 Cievny tonus. 12 4.1.3.5.3 Účinky na lipidy v krvi. 13 4.1.3.5.4 Hemostatické účinky. 14 4.1.3.5.5 Homocysteín. 14 4.1.3.5.6 Iné účinky estrogénu. 15 4.2 Vlastnosti izoflavónu, estrogénová aktivita a účinky na kardiovaskulárny systém. 16 4.2.1 Definícia, chémia a výskyt. 16 4.2.2 Estrogénna aktivita. 18

Obsah II 4.2.3 Izoflavóny a ich účinky na kardiovaskulárny systém. 19 4.2.3.1 Účinky na lipidy v krvi. 20 4.2.3.2 Cievna stena a vaskulárna funkcia. 21 4.2.3.3 Antioxidačné vlastnosti izoflavónov. 23 4.2.3.4 Zápalové procesy a adhézia buniek. 23 4.2.3.5 Izoflavóny, aktivita krvných doštičiek a trombogenéza. 4.3 Neinvazívne meranie endotelových funkcií: účinky estrogénov, izoflavónov a homocysteínu. 26 4.3.1 Metóda vazodilatácie indukovanej prietokom. 4.3.2 Steroidné hormóny a endoteliálna funkcia. 4.3.3 Izoflavóny a endoteliálna funkcia. 4.3.4 Homocysteínový rizikový faktor pre endotelovú dysfunkciu. 4.3.4.1 Interakcia homocysteín-estrogén a endoteliálna funkcia. 30 4.3.5 ADMA, nový kardiovaskulárny rizikový faktor. 30 4.4 Ciele tejto práce. 31 5 Dizajn štúdie a metódy vyšetrovania. 32 5.1 Návrh štúdie. 32 5.1.1 Nábor subjektov a profil požiadaviek. 33 5.1.1.1 Informačná udalosť. 34 5.1.2 Priebeh štúdia. 35 5.1.2.1 Zábeh. 35 5.1.2.2 Prvý zásah. 35 5.1.2.3 Vymytie. 35 5.1.2.4 Druhý zásah a absolvovanie štúdia. 36 5.2 Študujte jedlo a dodržiavanie predpisov. 36 5.3 Vyšetrovacie metódy. 37 5.3.1 Antropometria. 37 5.3.2 Príležitostné merania tlaku krvi. 5.3.3 Krvné testy. 38 5.3.4 Merania endotelových funkcií. 5.3.5 Močové testy. 42

Obsah III 5.3.6 Zaznamenávanie príjmu energie a živín. 44 5.3.7 Štatistické hodnotenie. 44 6 výsledkov. 46 6.1 Zmena veľkosti vzorky a všeobecných charakteristík. . 46 6.2 Súlad a vylučovanie fytoestrogénu. 47 6.3 Absorpcia energie a antropometrické parametre. 50 6.4 Príležitostné meranie tlaku krvi. 51 6.5 Zmeny krvných parametrov. 51 6.6 Endoteliálna funkcia a prietok krvi. 53 6.7 Vplyv stavu ekvolu. 54 6.8 Efekty pre jednotlivé krajiny. 55 7 Diskusia. 57 7.1 Záver. 69 8 Bibliografia. IX 9 Príloha. XXIX vďaka. LXXXII vyhlásenie nezávislosti. LXXXIII životopis. Publikácie LXXXIV. LXXXVI

Zoznam obrázkov V ZOZNAM OBRÁZKOV Obrázok 4-1 Zjednodušená ilustrácia patomechanizmu aterosklerózy. 6 Obrázok 4-2 Alternatívy k estrogénovo závislej modulácii transkripcie pomocou ER α-er β homo- a heterodimérov. 8 Obrázok 4-3 Mechanizmy relaxácie buniek hladkého svalstva oxidom dusnatým (NO) a cyklickým guanozínmonofosfátom (cgmp). 13 Obrázok 4-4 Štrukturálne porovnanie estrogénov a izoflavónov. 16 Obrázok 5-1 Návrh štúdie. Obrázok 5-2 Priemer cievy brachiálnej artérie sa meria v troch časových bodoch. 42 Obrázok 6-1 Porovnanie absolútnych zmien vo vylučovaní fytoestrogénov. 47 Obrázok 6-2 Klasifikácia účastníkov štúdie (N = 89) z hľadiska stavu ekv. 49 Obrázok 6-3 Porovnanie prevalencie výrobcov rovnakých koní v závislosti od štátnej príslušnosti. 49 Obrázok 6-4 Zmena koncentrácie dusitanov/dusičnanov (NOx) v priebehu intervencie. 55 Obrázok 7-1 Metabolizmus homocysteínu a tvorba ADMA. 64 Obrázok 7-2 Potenciálne mechanizmy pôsobenia izoflavónu na metabolizmus oxidu dusnatého. 67 Obrázok 7-3 Schematické znázornenie mechanizmov a účinkov zvýšenia homocysteínu. 68

Zoznam skratiek VII GEN Genistein GLM Zmiešaný lineárny model GLY Glyciteín GPx Glutatiónperoxidáza GTN-MD Na endotelu nezávislá na nitroglyceríne indukovaná vazodilatácia HDL lipoproteín s vysokou hustotou HERS Štúdia výmeny srdca a estrogénu/progestínu HRT Hormónová výmena Bunková molekula ICAMproteín 90 1 IL interleukín inos indukovateľná syntáza oxidu dusnatého IP 3 R inozitol trifosfátový receptor K-Mg-ATPáza adenzozín trifosfatáza závislá od draslíka a horčíka LDL lipoproteín s nízkou hustotou LH luteinizačný hormón L-NA NG -L-arginín L-NMMA NG-monometyl-l-arginín MAP (Anglický stredný arteriálny tlak) MAPK mitogénom aktivovateľná proteínkináza MCP-1 monocyty chemotaktický proteín-1 MLCP myozín ľahký reťazec fosfatáza (anglicky myosin ľahký reťazec fosfatáza) MTHFR 5, 10-metyléntetrahydrofolátreduktáza MW stredná hodnota Na sodík NADPH ox nikotínamid oxidáza NF -κB nukleárny faktor-kappa B NOx metabolity oxidu dusnatého N Veľkosť vzorky ONOO peroxynitrit P hladina významnosti PABA kyselina para-aminobenzoová PAHA kyselina para-aminohippurová PAI-1 aktivátor plazminogénu-1 PGI prostacyklín PKG proteínkináza G PLC fosfolipáza C

Zoznam skratiek VIII PRMT PWV RE ROCC ROS SAH SAM SBP SEM SMC SOD Soy + Soy- SPI SR TAVM TG thcy TNF TVP UK VCAM-1 VEGF VOCC WHI Proteín arginín metyltransferáza Rýchlosť pulzných vĺn (anglicky systolický krvný tlak štandardná chyba priemernej hodnoty myocyty, bunky hladkého svalstva (angl. bunky hladkého svalstva) superoxid dismutáza sójový proteín s izoflavónmi sójový proteín po extrakcii izoflavónov sójový proteín izolovať sarkoplazmatické retikulum stredná rýchlosť prúdenia krvi (angl. časová priemerná rýchlosť rýchlosť priemerná rastlinná nekroza faktor bunkový adhézny faktor Veľký bunkový adhézny faktor molekula-1 vaskulárny endoteliálny rastový faktor napäťovo riadené vápnikové kanály Iniciatíva pre zdravie žien

Výsledky 56 Tabuľka 6-11 Porovnanie absolútnych rozdielov v krvných parametroch v závislosti na národnosti Národnosť Rozdiel NOx [µmol/l] Wo8-Wo0 Rozdiel ADMA [µmol/l] Wo8-Wo0 Rozdiel homocysteín [µmol/l] Wo8-Wo0 Rozdiel v plazme Vitamín B-12 [pmol/l] Wo8-Wo0 rozdiel v plazmatickom foláte [nmol/l] Wo8-Wo0 Nemecko priemer -0,43-0,02 0,55 7,89 0,27 SEM 1,31 0,01 0, 19 8,71 0,39 Priemer Dánska -1,67-0,02 0,17-41,37-0,80 SEM 1,78 0,01 0,17 10,33 0,28 Priemer Spojeného kráľovstva -1,79 -0,01 0,35-12,66-1,36 SEM 1,30 0,01 0,18 10,99 0,57 Celkový priemer -1,23-0,02 0,37-13,86-0, 57 N = 89 SEM 0,85 0,01 0,11 5,89 0,25

Bibliografia XXVIII 407. Bloedon LT, Jeffcoat AR, Lopaczynski W, Schell MJ, Black ™, Dix KJ, Thomas BF, Albright C, Busby MG, Crowell JA, Zeisel SH. Bezpečnosť a farmakokinetika vyčistených sójových izoflavónov: podávanie jednej dávky postmenopauzálnym ženám. U J Clin Nutr. 2002; 76: 1126-37.

Príloha XXX Sprievodný list bývalým účastníkom testu Pani «Krstné meno» «Priezvisko» «Adresa» «Poštové smerovacie číslo» «Mesto» Rehbrücke, 20. januára 2003 Vážená pani «Meno», v adresári súboru s testovacími adresami máme vašu adresu Prevzaté z intervenčných štúdií so záujmom o účasť na nových projektoch. V rámci výskumného projektu Európskej únie uskutoční naše oddelenie v blízkej budúcnosti opäť štúdiu výživy. Cieľom tejto štúdie je preskúmať účinky stravy bohatej na sóju na kardiovaskulárny systém postmenopauzálnych žien. Hľadáme nefajčiarov, ktorí majú záujem o fajčenie vo veku od 45 do 70 rokov a mali poslednú menštruáciu najmenej pred rokom. Preto by sme vás chceli v najbližších dňoch kontaktovať telefonicky. Ak sme vzbudili váš záujem, radi vám poskytneme ďalšie informácie. Ak máte akékoľvek otázky vopred, pani Reimannová na ne samozrejme rád odpovie na vyššie uvedenom telefónnom čísle. Boli by sme radi, keby ste s nami spolupracovali. S pozdravom Dr. Oec. trofej. Corinna Koebnick Dipl. Ern. vedecká Manja Reimann

Príloha XXXII TELEFÓNNY ROZHOVOR Dátum:// Meno. Krstné meno. Adresa. PSČ/mesto. Telefón: súkromný/služobný/Dátum narodenia: Nefajčiar: Áno Nie// Posledná menštruácia:/Mesiac rok Hormonálna terapia: Áno Nie Účasť od apríla 2003. Október 2003. možné? Áno Nie Odoslať plán verejnej dopravy? Áno Nie Dotazník sa vrátil? Áno dátum.

Príloha LXII Zoznam čakateľov Pani «Krstné meno» «Priezvisko» «Ulica» «Poštové smerovacie číslo» «Mesto» Bergholz-Rehbrücke, 24. marca 2003 Predmet: Výsledky skríningového vyšetrenia Vážená pani «Priezvisko», ďakujeme vám za účasť na Ďakujem skríningové vyšetrenie. Namerané hodnoty nájdete v prílohe k listu. Konečné rozhodnutie o účasti na štúdii možno prijať, až keď budú k dispozícii výsledky skríningu všetkých zainteresovaných strán. Keďže skríningové vyšetrenia ešte nie sú úplne ukončené, prosíme o trochu trpezlivosti. Hneď ako výberový proces skončí, budeme vás informovať. S pozdravom Dipl. Ern. vedecká Manja Reimann

Príloha LXXI Vyhodnotenie kontroly Pani „Meno“ „Priezvisko“ „Ulica“ „Poštové smerovacie číslo“ „Mesto“ Bergholz-Rehbrücke, 18. novembra 2003 Vážená pani „Priezvisko“, zasielam vám vaše hodnoty krvi z posledného odberu krvi, ktorý sme odobrali na kontrolu Znova skontrolujte svoj zdravotný stav. Dúfam, že sa vám darí a že ste ešte nezaznamenali abstinenčné príznaky z našich barov. Už by som vám chcel popriať pekný prvý advent. Užite si prichádzajúce vianočné obdobie. Prajem všetko dobré do Nového roka Dipl. Ern. Vedomosti Manja Reimann

Príloha LXXIII Menovania na záverečné stretnutie Pani.

Bergholz-Rehbrücke, 26. októbra 2004 Vážení účastníci štúdie, po návrate z mojej osemmesačnej expedície na austrálskom kontinente sa opäť naplno venujem štúdiu Isoheart. S potešením vás informujem, že už boli vykonané takmer všetky analýzy a výsledky sú pripravené na zverejnenie. Aby som vám dal trochu viac informácií o tom druhom, rád by som vás srdečne pozval v utorok 7. decembra 2004 o 16:00 tu v Nemeckom ústave pre výskum výživy, dom E (hlavná budova) na záverečné stretnutie v uvoľnenej atmosfére. Prosím, informujte ma, či sa môžete zúčastniť (pani Vulprecht Tel. 033200-88 669; e-mail: [email protected]). V opačnom prípade by som vám poslal vaše osobné dokumenty poštou. Dúfam, že ich uvidím v hojnom počte a teším sa na vás všetkých znova. S pozdravom Dipl. Ern. vedecká Manja Reimann

Príloha LXXIV Odoslanie výsledkov štúdie Pani «Meno» «Priezvisko» «Ulica» «Poštové smerovacie číslo» «Mesto» Bergholz-Rehbrücke, 8. decembra 2004 Vážená pani «Priezvisko», Včera sa konalo záverečné stretnutie štúdie Isoheart. Pretože ste sa bohužiaľ nemohli zúčastniť, pošlem vám vaše osobné výsledky podľa dohody. Ak máte akékoľvek otázky, môžete mi kedykoľvek zavolať na moje obvyklé telefónne číslo (pozri vyššie). Chcem sa vám ešte raz veľmi pekne poďakovať za účasť na štúdii. Veselé Vianoce a šťastný nový rok vám prajeme. S pozdravom Dipl. Ern. vedecká Manja Reimann

Príloha LXXV Hodnotiace hárky subjektu Skríning: Hodnotiaci hárok 1 Predmet č. «Prob_Nr» Merané krvné parametre Hodnota Merná jednotka Normálny rozsah ženy ASAT «ASAT_Ul» U/l # 31 ALAT (-GT) «ALAT_Ul» U/l # 31 GGT «GGT_UL» U/l 9 -37 Kreatinín «Creatinine_moll» µmol/l 53,0-100 Triglycerid «TAG_in_mmoll» mmol/l 0,46 1,60 Rozsah prijatia Isoheart 6,5 Rozsah prijatia Isoheart 1,7 Glukóza nalačno «Glukóza_v_mmoll» mmol/l 3,61 6, 11 Rozsah akceptácie Isoheart 11 Hematokrit «Hk _»% 35-45 Leukocyty «Leuko_Gptl» Gpt/l 4,0 9,0 Krvné doštičky «Thrombo_Gptl» Gpt/l 140-450 Namerané parametre moču Hodnota Leukocyty «Leukos» Dusitany «Dusitany» Hodnota pH «Ph» bielkovina «bielkovina» glukóza «glukóza» ketóny «ketóny» urobilinogén «urobilinogén» bilirubín «bilirubín» krv «Blut_EryHgb» negat. Negat. (Normálna hodnota), poz. Pozitívne, normálne (normálna hodnota), 1. mierne zvýšené, 2. mierne zvýšené, 3. výrazne zvýšené

Príloha LXXVI Skríning: Hodnotiaci list 2 Testovaná osoba č. «Prob_Nr» Antropometria Hodnota Jednotka Výška «Výška_v_m» m Telesná hmotnosť «Váha_v_kg» kg Veľkosť pasu «Veľkosť pasu_cm» cm Veľkosť bedra «Veľkosť bedra_cm» cm Hodnota krvného tlaku Referenčné hodnoty jednotky podľa WHO Systole «Systole_mmHg» mm Hg optimálny rozsah: 120/80 diastola «Diastole_mmHg» mm Hg normálna: 130-139/85 89 hraničná: 140 149/90-94 závažnosť 1: 140 159/90-99 závažnosť 2: 160 179/100-109 závažnosť 3: 180/110 a vyššie Rozsah prijatia Isoheart: # 160/90 Vyhodnotenie: Kontrola parametrov krvi po ukončení každej intervenčnej fázy Číslo subjektu «id» Dátum odberu krvi: «datum_ba» Namerané parametre krvi Hodnota Jednotka merania Normálny rozsah ASAT «asat2» U/L # 31 ALAT (γ-gt ) «Alat2» U/L # 31 GGT «ggt2» U/L 9-37 kreatinín «crea2» µmol/l 53 100 močovina «močovina2» mmol/l 2,5-7,5 glukóza «gluc2» mmol/l 3, 61 6.11

Príloha LXXVII Vyhodnotenie protokolov odhadu za 3 dni ID Výživový protokol «ID» 1. 2. 3. 4. Odporúčaný príjem 1 za deň 2 Energia [kcal] «Energia0_kcal» «Energia8_kcal» «Energia16_kcal» «Energia24_kcal» 1800-2300 kcal Sacharidy [% ] «KH0_» «KH8_» «KH16_» «KH24_» 55-60% 3 bielkoviny [%] «EW0_» «EW8_» «EW16_» «EW24_» 10-15% 3 tuky [%] «Fat_PCT0» «Fat_PCT8» « Fat_PCT16 »« Fat_PCT24 »65 rokov 10 µg vitamínu C [mg]« Vit_C_0_mg »« Vit_C_8_mg »« Vit_C_16_mg »« Vit_C_24_mg »100 mg kyselina listová [µg]« folát0_g »« folát8_g »« folát16_g »« µg vitamín B12 »400 µg ] «B12_0_g» «B12_8_g» «B12_16_g» «B12_24_g» 3 µg minerálov Vápnik [mg] «Ca0_mg» «Ca8_mg» «Ca16_mg» «Ca24_mg» 1 000 mg Horčík [mg] «Mg0_mg» «Mg8_mg» «Mg16_mg» «Mg24_mg 300 mg železa [mg] «Fe0_mg» «Fe8_mg» «Fe16_mg» «Fe24_mg» 10 mg 1 Nemecká spoločnosť pre výživu: Referenčné hodnoty pre príjem živín, Umschau-Verlag 2000 2 Informácie platia pre ženy vo veku 51 a viac rokov 3 na základe celkového príjmu energie 4 smerom k celkovému tuku jazdil

Príloha LXXVIII Definície vybraných parametrov pre účastníkov štúdie Definície BMI: Meranie telesnej hmotnosti vo vzťahu k veľkosti tela. Je lepšou mierou obezity ako samotná telesná hmotnosť. Pomer pás-bok: je pomer pása a bokov. Je mierou distribúcie telesného tuku. Riziko kardiovaskulárnych chorôb stúpa s vyššou distribúciou tuku v oblasti pása (tvar jablka). SBP: systolický krvný tlak Krvný tlak bezprostredne po vylúčení krvi zo srdca do aorty. DBP: diastolický krvný tlak Krvný tlak bezprostredne pred ďalším výdajom krvi. FMD: označuje percentuálnu zmenu priemeru cievy po zvýšení prietoku krvi. Je mierou vaskulárnej funkcie. SAC: miera systémovej arteriálnej zhody elasticity tepien. HDL: dobrý cholesterol, ktorý sa prenáša z krvných ciev do pečene. LDL: zlý cholesterol, ktorý sa prenáša z pečene do krvných ciev. Triglyceridy: Lipidy v krvi sú mierou rizika kardiovaskulárnych chorôb. Homocysteín: rizikový faktor pre srdcovo-cievne ochorenia Kyselina listová: vitamín nevyhnutný na odbúravanie homocysteínu

Príloha LXXIX Individuálne hodnotenie intervencií Osobné výsledky štúdie Isoheart 2003 Prob.č. «ID» - prísne dôverné - prvá intervenčná liečba «liečba1» začiatočná hodnota 4. týždeň 8. BMI «BMI1» «BMI2» «BMI3» pomer bedra a bedra «WHR1» «WHR2» «WHR3» SBP/DBP «SBP1»/« DBP1 »« SBP2 »/« DBP2 »« SBP3 »/« DBP3 »Celkový cholesterol [mmol/l]« TC1 »« TC2 »« TC3 »LDL [mmol/l]« LDL1 »« LDL2 »« LDL3 »HDL [mmol/l] «HDL1» «HDL2» «HDL3» triglyceridy [mmol/l] «TAG1» «TAG2» «TAG3» priemer pokojovej cievy «BDIA1» [mm] SAC [dyn * s/cm-5] «SAC1» «SAC2» homocysteín [µm/l] «HCY_1» «HCY_2» kyselina listová [nmol/l] «FOL_1» «FOL_2» druhá intervenčná liečba «liečba2» východisková hodnota 4. týždeň 8. BMI «BMI4» «BMI5» «BMI6» pomer bedra a bedra « WHR4 »« WHR5 »« WHR6 »SBP/DBP« SBP4 »/« DBP4 »« SBP5 »/« DBP5 »« SBP6 »/« DBP6 »Celkový cholesterol [mmol/l]« TC4 »« TC5 »« TC6 »LDL [mmol/l] «LDL4» «LDL5» «LDL6» HDL [mmol/l] «HDL4» «HDL5» «HDL6» Triglyceridy [mmol/l] «TAG4» «TAG5» «TAG6» priemer pokojovej cievy [mm] «BDIA3» SAC [dyn * s/cm-5] «SAC3» «SAC4» homocystein [µm/l] «HCY_3» «HCY_4» kyselina listova [nmol/l] «FOL_3» «FOL_4» Equolpr producent: „Equol_Producer“

Príloha LXXX Záverečná správa pre účastníkov štúdie Isoheart: List 1-2 Správa pre účastníkov štúdie Isoheart 2003 Účinky sójových fytoestrogénov na kardiovaskulárny systém postmenopauzálnych žien: placebom kontrolovaná, randomizovaná, dvojito zaslepená, krížová intervenčná štúdia Autor dizajnu: Manja Reimann Upozorňujeme, že obsah tejto správy je prísne dôverný. Tu zhrnuté výsledky boli predložené na zverejnenie v medzinárodne uznávanom odbornom časopise, a preto nemôžu byť nikomu mimo štúdie poskytnuté skôr, ako bude publikovaná.