Univerzita veterinárskeho lekárstva Hannover

1 Univerzita veterinárskeho lekárstva v Hannoveri Vyšetrovanie obsahu rozpustného fosforu v supernatante zo suspendovaného inkubovaného krmiva pre ošípané - Prístupy k diferencovanejšiemu hodnoteniu P - NESPRÁVNE ZATVORENIA zamerané na získanie titulu doktor veterinárneho lekárstva - Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. Vet.) uvádza Denise Marcelle Pohl Braunschweig Hannover 2015

2 Vedecký dozor: Univ.-Prof. DR. J. Kamphues Inštitút pre výživu zvierat 1. Recenzent: Univ.-Prof. DR. J. Kamphues 2. recenzent: Univ.-Prof. DR. Deň ústnej skúšky P. Steinberga: 12. mája 2015

6 OBSAH Obsah 1 Úvod Literatúra Dôležitosť chovu ošípaných v Nemecku Fosfor pri kŕmení ošípaných Dôležitosť a regulácia metabolizmu P Potreba, absorpcia a vylučovanie P Zvláštnosti fytínu P a jeho vlastných fytáz Dôležitosť pridaných fytáz v kŕmení ošípaných Stráviteľný alebo dostupný fosfor? Nedostatok a prebytok P Všeobecné požiadavky na kŕmenie ošípaných Prasiatka Výkrmové ošípané Chovné prasnice Chovné kance Materiál a metódy Cieľ/prehľad testu Krmný materiál materiálu Krmné zmesi Krmné zmesi Metódy Laboratórne testy Príprava vzoriek Analýzy živín Štatistické vyhodnotenie Výsledky Identifikácia metódy. 39

7 OBSAH Predbežný experiment Predbežný experiment Predbežný experiment Stanovenie metodiky na stanovenie vo vode rozpustného fosforu H20 rozpustného P v jednom FM v inkubačnej dobe 90 minút H20 rozpustného P v jednom FM po tepelnom spracovaní, tj. Po inaktivácii akýchkoľvek fytáz H 2 O-rozpustný P v jednom FM pri rôznych inkubačných teplotách a pod vplyvom fytázy H20 rozpustný fosfor v kompletnom krmive pre ošípané Fosfor rozpustný v HCl v krmive (inkubácia v 0,35% HCl) Fosfor rozpustný v HCl v kŕmnych fosfátoch HCl- Rozpustný alebo v H20 rozpustný fosfor v kŕmnej zmesi pre ošípané Diskusia Kritika metodiky Zostavenie testu a predbežné testy Laboratórne testy Počet použitých vzoriek Diskusia k výsledkom Porovnanie vlastných výsledkov jednotlivých krmív s fosforom rozpustným v H20 a HCl s údajmi z literatúry Porovnanie vlastných výsledkov na H 2 O- a HCl-rozpustný fosfor pre krmivo pre ošípané s dátumom uvedeným v literatúre n Závery Zhrnutie Zhrnutie Bibliografia

8 OBSAH 9 Príloha Tabuľka Príloha

9 ZOZNAM SKRATIEK Zoznam skratiek ± s štandardná odchýlka zapísanej ochrannej známky AF kompletné krmivo AP alkalická fosfatáza ATP adenozíntrifosfát AfBN výbor pre normy BFS bakteriálna fermentovateľná látka BSE bovinná spongiformná encefalopatia napr. Napríklad dp S ohľadom na cca . deň (deň) DCP dikalciumfosfát DE nemecké ušľachtilé ošípané DFP defluorovaný fosfát d. H. to je DL Deutsche Landrasse Du Duroc ES Extraktionsschrot a kol. et alii (a ďalší) atď. et cetera EÚ Európska únia možno prípadne

10 ZOZNAM SKRATIEK Spoločnosť FM Futtermittel FTU Fytázová aktivita (anglicky Phytase Unit) GfE Spoločnosť pre výživovú fyziológiu ak je to potrebné, ak je to potrebné, nízka hladina h hodina (y) HClsP rozpustná v kyseline chlorovodíkovej P (HCl rozpustná P) hgr. vysoko ed. editor i. e. angl. id est (t.j.) vrátane vrátane k pf KM LM LMZ LWK MCP MDCP ME ME m MF MgP mgr. min MW n Čiastočná účinnosť ME s pre vstup energie do bielkovín a tukov Telesná hmotnosť Živá hmota Prírastok živej hmoty Poľnohospodárska komora Fosforečnan vápenatý Monofosforečnan vápenatý Metabolizovateľná energia (konvertovateľná energia) Požiadavka na zachovanie kŕmnej zmesi ME, fosforečnan horečnatý, stredná hodnota minút, stredná hodnota číslo n. N. Nezistiteľné číslo. Počet

11 ZOZNAM SKRATIEK n. Pozri štatisticky nevýznamné neškrobové polysacharidy NSP n. A vyššie sa neskúmali. vyššie spomenutý orgán. organický p význam (pravdepodobnosť chyby) Pi Pietrain r korelačný koeficient Ra surový popol RES repkový šrot Rp surový proteín S. strana Sc. Znak sójovej extrakcie jedla Streptococcus SES. výrazne tzv. spp. Druh TS sušina U jednotka u. A. okrem iného z pôvodnej látky za určitých okolností a. najmä Združenie nemeckých poľnohospodárskych skúšobných a výskumných ústavov VDLUFA rôzne rôzne stráviteľné fosfory vs. pšeničné otruby WK

12 ZOZNAM SKRATIEK w.s.p angl. vo vode rozpustný P (vo vode rozpustný fosfor) napr. B. napríklad kyselina citrónová z. Niektoré chemické prvky sú skrátené podľa pravidiel medzinárodnej nomenklatúry (IUPAC).

23 PUBLIKÁCIE ovplyvňujúce kosti (v porovnaní s izogénnou kukuricou). HEMME (2004) vysvetľuje, že pridanie fytázy do krmiva znížilo komplexotvorné vlastnosti fytátu vo vzťahu k stopovým prvkom, aminokyselinám, škrobu a lipidom, a tým zvýšilo stráviteľnosť týchto zložiek. Prehľad celkovej aktivity P, fytín-P a fytázy v rôznych zložkách krmiva poskytuje GODOY et al. (2005) v nasledujúcej tabuľke: Tabuľka 2: Obsah celkovej aktivity P, fytín-P a fytázy vo vybraných priamych krmivách (n = 5 každý; podľa GODOY et al. 2005). Zložka celkový P [%] Fytín-P [%] Fytín-P% [v. Celkový P] fytázový akt. [U/kg DM] Obilie a vedľajšie produkty Pšenica 0,33 Ω, kukurica 0,25 Ω, ryža 0,12 Ω, cirok 0,26 Ω, pšeničné otruby 0,92 Ω, nahrubo odtučnená sadba kukurice a 0,66 Ω, šupka Jemne odtučnená sadba kukurice a 1,21 0, šupka pivovarského zrna 1,22 0, ryžové otruby 1,57 1, olejnaté semená a vedľajšie výrobky z bavlníkových semien 0,64 0, sója ES 0,57 0, bavlna ES 1,34 0, palmový olej ES 0,51 0, kokosový ES 0,43 0,

35 SCHRIFTTUM Prasiatka Ďalej sú uvedené odporúčania GfE (2006) pre chov prasiatok, pokiaľ ide o ME (MJ/d) a stráviteľný fosfor (vp). Vytvárajú sa nasledujúce predpoklady: ME m (MJ/d) = 0,55 LM kg 0,75, obsah bielkovín v prírastku LM je konštantný na 170 g/kg a obsah tuku v prírastku LM sa zvyšuje zo 110 g/kg ( 10 kg LM) až 170 g/kg (30 kg LM). Čiastočná účinnosť ME pre energetický prístup v bielkovinách a tukoch (k pf) sa uvádza ako 0,70. Odporúčané hodnoty pre stráviteľný fosfor (vp g/d) sú uvedené v zátvorkách pod hodnotami konvertibilnej energie. Tab. 3: Odporúčania pre zásobovanie ME (MJ/d) a vp (g/d) v chove prasiatok (podľa GfE 2006). LMZ [g/d] LM [kg], 9 1) (0,6) 4,1 (1,1) 5,2 (1,6) 4,3 (0,6) 5,5 (1,2 ) 6,7 (1,7) 7,9 (2,2) 9,1 (2,7) 8,0 (1,7) 9,3 (2,3) 10,6 (2,8) 11, 8 (3,3) 1) bez zátvoriek = ME (MJ/d); s konzolami = vp (g/d) 9,3 (1,8) 10,6 (2,3) 12,0 (2,8) 13,3 (3,4) 14,7 (3,9) 11, 9 (2,4) 13,4 (2,9) 14,8 (3,4) 16,2 (4,0) 17,7 (4,5) 13,2 (2,5) 14,7 (3,0) 16,2 (3,5) 17,7 (4,0) 19,3 (4,5) 23

39 SCHRIFTTUM Tab. 7: Odporúčania pre starostlivosť o gravidné prasnice s ME (MJ/d) a vp (g/d) (podľa GfE 2006). Gestačné číslo Požiadavka na MOM Strata LM počas laktácie: 0 kg LM pri prikrývaní [kg] UU celkom [MJ/d] v nízkej hmotnosti MOM celkom [MJ/d] vysoko tehotná strata LM počas laktácie: 10 kg LM pri prikrývaní [kg] MJ celkom [MJ/d] nízka MJ celkom [MJ/d] strata vysokej hmotnosti LM počas laktácie: 20 kg LM pri párení [kg] MJ celkom [MJ/d] nízka hmotnosť MOM celkom [MJ/d] vysoká hmotnosť vp Fosfor stráviteľný v tehotenstve [g/d] Nízky obsah 4,0 1,9 2,4 2,7 Vysoký obsah 6,2 6,6 6,9 6,9 Obdobie 1,9 2,4 2,7 27

40 SCHRIFTTUM Boli urobené nasledujúce predpoklady: - ME m: 0,44 MJ/kg LM 0,75 a deň (priemerný LM v príslušnej fáze) - denný prístup k rastu, ktorý u gravidných prasníc stále prebieha: 2,4 g P - prírastok u matky rovnomerne rozložené po celú dobu - energia v koncepčných produktoch: 1 (slabo únosná) alebo 2,5 MJ/d (vysoko únosná) - retencia energie v mliečnej žľaze: 1 MJ/d (iba únosne) - využitie ME pre koncepčné výrobky: 50% - Energetický obsah v prírastku matky: 12 MJ/kg - využitie ME pre prírastok matky: 70%. VFT (2009) ukazuje dve kompletné krmivá pre gravidné prasnice (špeciálne krmivo pre gravidné prasnice s 0,41 g P/MJ ME a štandardné krmivo pre gravidné prasnice s 0,45 g P/MJ ME), obe s maximom Obsah 12,4 MJ ME/kg (poznámka o znížení hrubého obsahu P: asi 1 g/kg alebo 0,08 g/mJ ME, keď sa pridá fytáza, ako u prasiatok a výkrmových ošípaných, pozri vyššie). Ďalej sú uvedené odporúčania GfE (2006) pre laktujúce prasnice, pokiaľ ide o ME (MJ/d): 28

41 SCHRIFTTUM Tab. 8: Odporúčania pre zásobovanie laktujúcich prasníc ME MJ/d (doba dojčenia 25 d; podľa GfE 2006). Prírastok vrhu [kg/d] 1,5 2,0 1,5 2,0 2,5 2,0 2,5 3,0 Strata LM [kg] LM na začiatku laktácie [kg] Nasledujúca tab 9 GfE (2006) týkajúce sa odporúčaní pre stráviteľný fosfor (g/d) počas laktácie. Tab. 9: Odporúčania pre kŕmenie laktujúcich prasníc vp (g/d; podľa GfE 2006). LM [kg] Prírastok vrhu [kg/d] 1,5 2,0 2,5 3, 3 15,8 19,1 22, 5 16,0 19,3 22, 7 16,2 19,5 22, 9 16,4 19,8 23, 1 16,6 20,0 23, 4 16,8 20,2 23,5 Boli urobené nasledujúce predpoklady: - ME m: 0,44 MJ/kg LM 0, 75 a denná výroba mlieka na 1 kg hmotnostného prírastku prasiatka: 4,1 kg 29

43 SCHRIFTTUM WEBER (2011) v tejto súvislosti poukazuje na to, že diviaky majú pre ME o 8–10% nižšiu dennú potrebu ako Börgen a potrebujú prírastok 34,15 ME MJ/kg (Börge v porovnaní: 37,31 ME MJ/kg prírastku). Podľa KEMP (1989) a ROTH (2008) sa majú diviaky počas chovu kŕmiť takým spôsobom, aby boli primerane zásobené energetickým príjmom MJ ME/d (v závislosti od hmotnosti zvieraťa a od toho, či je potrebné sa vyhnúť obezite). GfE (2006) uvádza celkovo 12,0 g alebo 7 g stráviteľného fosforu denne u chovných kancov. 31

50 MATERIÁL A METÓDY - Výpočet aritmetického priemeru (Ø) pri kombinácii viacerých jednotlivých hodnôt - Výpočet smerodajnej odchýlky (± s) ako miera disperzie jednotlivých hodnôt Predpokladalo sa, že distribúcia hodnôt náhodných premenných je kvôli malej veľkosti vzorky normálne rozdelená. 38

52 VÝSLEDKOV - Kyselina chlorovodíková 0,35% - Kyselina citrónová 2% - Inkubačná teplota: 41 ° C, vo vyhrievacej komore - Inkubačná doba: 2 h, za stáleho miešania - Spopolnenie supernatantu po centrifugácii a stanovenie P pomocou metódy vanadát molybdénan At Okrem ultračistej vody sa ako najjednoduchšie médium pre použité roztokové médium použilo 0,35% kyseliny chlorovodíkovej (HCl). Hodnota je založená na KOLB (1989), ktorý špecifikuje koncentráciu HCl v obsahu žalúdka ošípaných na 0,3-0,4%, ako aj na výpočtoch podľa BODMANNA (2010), ktorý ukazuje priemernú koncentráciu HCl v obsahu morčacích žalúdkov 0,33%. Použitie 2% kyseliny citrónovej je dobre známou metódou pri skúmaní hnojív obsahujúcich P, pomocou ktorých sa určuje fosfor dostupný v rastlinách (t. J. Nie ako kritérium kvality celkový P, ale P rozpustný v kyseline citrónovej). Pretože pri tomto prvom prístupe (a čiastočne aj neskorších prístupoch) sa mali zhromaždiť základné údaje o krmive pre ošípané aj brojlery, bola pôvodne zvolená inkubačná teplota 41 C (vnútorná teplota tela brojlerov). 40

56 VÝSLEDKY Predbežný experiment 3 V treťom experimente na zhromažďovanie základných údajov sa kompletné krmivo pre morky tiež podrobnejšie skúmalo na rozpustný P pomocou systematického testu v troch čiastkových krokoch. Za týmto účelom v prvom kroku (stupeň mletia) s použitím P2 od výrobcu 3 platili nasledujúce podmienky: - Stupeň mletia: nemleté, nahrubo zomleté, jemne zomleté (0,5 mm) - Použité médium roztoku: ultračistá voda - Inkubačná teplota: 20 C (izbová teplota) - Inkubačný čas: 90 minút (za stáleho miešania) - spálenie zvyšku a supernatantu a stanovenie P v nich obsiahnutých pomocou metódy vanadát-molybdenan. Obrázok 2 ukazuje, že so zvyšujúcou sa intenzitou mletia neustále stúpal podiel fosforu, ktorý išiel do roztoku (s 28,7 mg fosforu v prístupe). V nemletej vzorke sa našlo v priemere 17,6 mg fosforu na chrbte a 12,8 mg v supernatante; s hrubo mletými vzorkami 16,9 mg fosforu na chrbte a 13,6 mg v supernatante a s jemne mletými vzorkami 15,3 mg fosforu na chrbte a 15,7 mg v supernatante. Je potrebné poznamenať, že kvôli vysokému zriedeniu a konverzii sú hodnoty mierne nad celkovým P (28,7 mg v prístupe). 44

57 VÝSLEDKY Obr. 2: Inkubácia AF pre morčacie kurčatá vo vodnom roztoku ako funkcia intenzity mletia. V druhom kroku (t. J. Na kontrolu možného vplyvu inkubačnej doby) boli s MF P2 od výrobcu 3 opäť vybrané nasledujúce podmienky: - Stupeň mletia: jemne mletý (0,5 mm) - Použité roztokové médium: ultračistá voda - Inkubačná teplota: 20 C (teplota miestnosti) - Inkubačné doby: 20 min., 60 min., 90 min., 120 min., 180 min. (Za stáleho miešania). - Spaľovanie zvyšku a supernatantu a stanovenie fosforu obsiahnutého v každej z nich metódou vanadát-molybdenan. Obrázok 3 ukazuje, ako so zvyšujúcou sa inkubačnou dobou kontinuálne rastie fosfor v zadnej časti na fosfor v supernatante (s 28,7 mg fosforu v dávke); Po 20 minútach sa v chrbte našlo priemerne 18,3 mg fosforu a 13,3 mg v supernatante; po 60 minútach 18,0 mg fosforu v zadnej časti a 14,4 mg v supernatante; po 90 minútach 17,5 mg fosforu v zadnej časti a 16,0 mg v supernatante; po 120 minútach 16,3 mg fosforu na chrbte a 15,5 mg v supernatante a po 180 minútach 16,6 mg fosforu na chrbte a 16,2 mg v supernatante. Aj tu 45

58 VÝSLEDKY, že kvôli vysokému riedeniu a konverzii sú hodnoty mierne nad celkovým P (pri 28,7 mg v prístupe). Obrázok 3: Porovnanie hladín P vo zvyšku a supernatante AF pre morčacie kurčatá s rôznymi inkubačnými dobami. V treťom kroku (t. J. Na kontrolu možného vplyvu inkubačnej teploty po suspendovaní vo vode) sa použil P2 od výrobcu 2 za nasledujúcich podmienok: - Stupeň mletia: jemne mletý (0,5 mm) - Použité médium roztoku: voda - Inkubačné teploty: 20 C (teplota miestnosti), 30 ° C, 40 ° C, vo vyhrievacej skrini - inkubačná doba: 90 minút (za stáleho miešania) - spálenie zvyšku a supernatantu a stanovenie P obsiahnutého v každej z nich metódou vanadát-molybdenan. Obrázok 4 ukazuje množstvo rozpustného fosforu so zvyšujúcimi sa inkubačnými teplotami (s 26,8 mg fosforu v dávke), s maximálnou hodnotou pri 30 ° C. Pri 20 ° C sa naopak zistilo priemerne 13,1 mg fosforu a 11,6 mg v Preniesol sa cez; pri 30 ° C 14,6 mg fosforu na chrbte a 11,9 mg v supernatante a pri 40 ° C 13,4 mg 46

59 VÝSLEDKOV Fosfor v zadnej časti a 11,4 mg v supernatante. Ak sa inkubujú 90 minút, t.j. H. Suspenzia vo vode, teplota v inkubačnom médiu nehrala významnú úlohu. V porovnaní s 20, 30 a 40 ° C bol rozdiel v rozpustnosti P iba 3,5%. Na tomto pozadí padla voľba na 20 ° C (teplota miestnosti) pre všetky nasledujúce vyšetrovania. Obrázok 4: Porovnanie hladín P vo zvyšku a supernatante AF pre morčacie kurčatá pri rôznych inkubačných teplotách. Z predchádzajúcich výsledkov (kroky 1 až 3) boli urobené nasledujúce rozhodnutia týkajúce sa podmienok prípravy a inkubácie: 1. Stupeň mletia: 0,5 mm. 2. Rozpúšťadlo pre jednotlivé zložky a zložky MF: ultračistá voda a HCl (0,35%). 3. Inkubačná teplota: 20 ° C (izbová teplota). 4. Inkubačný čas: 90 min. Na testovanie reprodukovateľnosti výsledkov sa stanovenie P uskutočnilo päťkrát so vzorkou pšenice aj SES; zodpovedajúce výsledky sú uvedené v tabuľke 11. Tu je zrejmé, že pri pšenici je pri použití H20 aj HCl v priemere veľmi podobných 47