In vitro analýza

Pre mnoho štúdií, ktoré nie sú na testovaných osobách možné, sú stále dôležitejšie in vitro testovacie postupy.

U kozmetických výrobkov, ktoré sa často používajú po dlhú dobu, je dermatologické testovanie bezpečnosti nevyhnutným predpokladom vysokej bezpečnosti aplikácie a spokojnosti zákazníka. Stanovením a vyhodnotením spoľahlivých a reprodukovateľných biologických koncových bodov na základe histologických a biochemických analýz je možné urobiť vyhlásenie o účinkoch produktu na regeneračné biologické procesy pokožky.

Pre takéto vyšetrenie je zvlášť vhodný 3D model pokožky, pretože tvorí prirodzenú histologickú sekvenciu vrstiev epidermálnych buniek a dermálnych štruktúr, ako je známe z ľudskej pokožky. Stratum basale, bazálna vrstva keratinocytov, leží priamo na živom ekvivalente dermis (fibroblasty) a histologicky za ním nasledujú stratum spinosum a stratum granulosum, ktoré sú nakoniec pokryté zrohovatenými bunkovými vrstvami stratum corneum.
Kvantitatívne a kvalitatívne možno analyzovať a hodnotiť poruchy pravidelnej epidermálnej cornifikácie (ortokeratózy) spôsobené rôznymi stimulmi fyzikálneho (mechanického, UV-A/B) alebo chemického (SLS).

V štúdiách in vitro skúmame:

Integrita kožnej bariéry/regenerácia po poškodení,
Poškodenie UVA/B,
Kompatibilita produktu.

epidermálna diferenciácia,
Kožná bariéra príslušných štruktúr,
vitalita,
Integrita dermo-epidermálnej zóny (DEJ),

Morfologicko-histologické štruktúry po špeciálnom zafarbení,
Imunofluorescenčné farbenie proteínov podieľajúcich sa na diferenciácii korneocytov,
Kvantifikácia interleukínov (napr. IL-1α, Il-6) pomocou testu s imunoabsorbentom viazaným na enzým (ELISA),
ďalšie vývojové metódy.

Histologická analýza

Histológia je veda o biologických tkanivách (histos = tkanivo a logos = výučba). Pomocou histológie je možné pomocou špecifického zafarbenia zviditeľniť tkanivovo-morfologické zmeny na bunkovej úrovni a podľa toho ich vyhodnotiť. Najbežnejším farbením používaným v histológii a histopatológii je farbenie H&E. Tu sú nukleové kyseliny sfarbené intenzívne tmavomodro, cytoplazma a väzivo ružovo-červené. Na obrázku nižšie je znázornené sfarbenie zdravého modelu (A) a poškodeného modelu vystaveného UVB (B) pomocou H&E.

Hematoxilín a eozín (H&E) zafarbenie ultratenkého rezu A) neošetrený model B) UVB ožarovaný model (250 mJ/cm2) po 48 hodinách. zatvorené šípky: bunky spálené slnkom; otvorené šípky hydropické články (masívne hromadenie tekutiny). *: typická dyskeratóza (porucha rohovky) po vystavení UV žiareniu.

Model zobrazuje všetky fyziologické vrstvy (stratum basale, spinosum, granulosum a corneum) natívnej ľudskej kože, ako aj skutočnú rohovku (A). Obrázok B zobrazuje model 48 hodín po vystavení UVB (250 mJ/cm2).
Typické znaky úpalu sú jasne rozpoznateľné. Početné takzvané „slnkom spálené bunky“ (zatvorená šípka), hydropické bunky, ktoré obsahujú viac tekutín a menej zafarbené jadro (otvorené šípky), ako aj typická porucha rohovky (dyskeratóza).
Okrem toho je možné pozorovať izolované vákuované keratinocyty. Pomocou tohto modelu je možné na bunkovej úrovni preskúmať a vyhodnotiť ochrannú funkciu (ochrana pred slnkom) a/alebo regeneračný potenciál formulácie alebo jednotlivých látok.

Analýza rýchlosti bunkového delenia

Rýchlosť bunkového delenia (proliferácie) je dôležitým ukazovateľom vitality alebo „vhodnosti“ tkaniva. V ľudskej pokožke sú schopné bunkového delenia iba keratinocyty stratum basale (bazálne keratinocyty). Tieto kompenzujú stratu korneocytov v dôsledku permanentného procesu exfoliácie, čím zaisťujú homeostázu tkaniva a zabraňujú bunkovému rednutiu pokožky.

Ultra tenká časť modelu s plnou pokožkou. A) obraz svetlého poľa B) fluorescenčný obraz. Modrá = bunkové jadrá, červená: deliace sa bunky.

Pomocou technológie Click-It EdU® možno bazálne keratinocyty epidermy a fibroblasty dermy špecificky označiť (A + B) na modeli kože počas bunkového delenia (mitózy). Na základe toho sa dá určiť, či látka alebo formulácia ovplyvňuje chovanie bunkového delenia po definovanom miestnom alebo systémovom čase aplikácie a liečby.
Uskutočnenie neošetrenej kontroly umožňuje kvantifikovať percento rýchlosti bunkového delenia. Príklady zvýšenej aktivity delenia buniek: hojenie rán, zápalové procesy.

Integrita bariéry kože

Ďalším dôležitým parametrom pre zdravú pokožku je neporušená kožná bariéra, ktorá na jednej strane zabraňuje nadmerným stratám vody a na druhej strane predstavuje účinný ochranný štít pred patogénmi, vplyvmi prostredia a (chemickými) škodlivými látkami.

Ultra tenká časť modelu s plnou pokožkou. A) Ošetrenie sterilným PBS B) Ošetrenie 45 minút s 1% SDS.
Modrá = bunkové jadrá, zelená: farbenie Lucifer Yellow.

Jednotlivé látky, kompletné formulácie alebo chemické látky Noxae môžu ovplyvniť celistvosť kožnej bariéry. To môže viesť k zvýšeným stratám vody (zvýšené odparovanie) a absorpcii škodlivých látok z prostredia, ktoré sa (pasívne) dostávajú do pokožky. V modeli s plnou pokožkou je možné pomocou znázornenej žltej farby Lucifer zistiť, či produkt ovplyvňuje bariéru pokožky. Sterilná voda alebo PBS (fosfátom pufrovaný soľný roztok) nemajú žiadny vplyv na integritu bariéry (A). Topicky aplikované farbivo zostáva úplne v horných vrstvách kože (stratum corneum).
45-minútové ošetrenie povrchovo aktívnou látkou SDS (1%) však vedie k poškodeniu kožnej bariéry (B). Farbivo preniká do hlbších vrstiev kože (dermis). Táto metóda sa môže použiť aj na zistenie, či výrobok dokáže po poškodení obnoviť bariérovú funkciu.